삼성바이오로직스 공정엔지니어링 직무 PT에서 자주 나오는 문항이 있다. “배양 후반에 온도를 낮추면 생산성 외에 무엇이 달라지는가”, “같은 세포주로 만든 항체인데 배치마다 산성 봉우리 비율이 다른 이유는 무엇인가” 같은 것이다. 두 질문의 답은 같은 곳에서 나온다. PTM (post-translational modification)이다.
그런데 PTM을 설명해 보라고 하면 “당쇄가 붙는 것”에서 멈추는 경우가 많다. 당쇄 말고 어떤 변형이 있는지, 그 변형이 배양기 안에서 생기는지 정제 중에 생기는지 보관 중에 생기는지, 그리고 그중 무엇이 핵심품질특성 (CQA)이고 무엇이 아닌지까지 이어서 말하는 지원자는 드물다. 공정엔지니어링 직무에서 이 구분이 중요한 이유는, 공정 인자를 바꾸는 사람이 그 인자가 어느 변형을 움직이는지 알아야 하기 때문이다.
이번 글에서는 항체의약품에서 나타나는 PTM을 갈래별로 정리하고, 각 변형이 어디에서 생기며 무엇을 바꾸는지, 배양과 정제의 어떤 인자가 그 변형을 움직이는지, 그리고 그중 어느 것을 핵심품질특성으로 관리하는지를 차례로 정리한다.
“DNA 서열이 하나인데 왜 항체는 한 가지 분자가 아니라 수십 가지 변이체의 혼합물인가?” “배양 조건이 어떻게 당쇄를 바꾸는가?” “변이체 가운데 어느 것이 핵심품질특성이고 어느 것은 아닌가?” 공정 직무를 준비하면서 한 번쯤 걸렸을 질문이다. 본문에서 하나씩 답한다.
PTM의 정의
주형이 없는 단계
단백질의 아미노산 서열은 DNA가 정한다. 그러나 서열이 완성된 뒤에 일어나는 변형에는 주형이 없다. 어떤 당이 어디에 얼마나 붙는지는 그 세포가 그 순간 가지고 있는 효소의 양, 효소가 쓰는 기질 (뉴클레오티드 당)의 공급, 골지체 안의 pH, 단백질이 골지체를 지나는 시간에 따라 정해진다. 그래서 같은 유전자에서 나온 항체라도 분자마다 붙어 있는 당쇄가 다르고, 배양 조건이 달라지면 그 분포가 달라진다.
ICH Q6B는 이 점을 정면으로 인정한다. “살아 있는 생물이 단백질을 만드는 생합성 과정 때문에 단백질에는 본질적으로 일정 수준의 구조적 불균일성이 생기며, 따라서 목적물은 예상되는 PTM 형태 (예: 당형)의 혼합물일 수 있다”고 적는다. 여기서 첫 번째 궁금증에 답할 수 있다. 항체가 한 가지 분자가 아니라 혼합물인 것은 결함이 아니라 생물 발현계의 본질이며, 규제는 그 혼합물을 없애라고 하지 않고 “불균일성의 패턴을 정의하고, 비임상과 임상에 쓴 배치와 일관됨을 입증하라”고 요구한다.
같은 문서는 “불균일성은 원액이나 완제의 제조 또는 보관 중에도 생길 수 있다”고 덧붙인다. 즉 변형은 세포 안에서만 생기는 것이 아니다. 정제 중의 pH 노출, 보관 중의 온도와 빛도 변형을 만든다. 이 글에서 “PTM”이라고 할 때는 세포 안에서 일어나는 효소적 변형과, 그 뒤 공정과 보관 중에 일어나는 화학적 변형을 함께 다룬다. 면접에서도 둘을 나누어 말하면 이해의 깊이가 드러난다.
공정엔지니어링 직무와의 접점
ICH Q8은 핵심품질특성을 “원하는 제품 품질을 보장하기 위해 적절한 한계, 범위 또는 분포 안에 있어야 하는 물리적, 화학적, 생물학적 또는 미생물학적 성질이나 특성”으로 정의한다. 항체의약품에서 이 정의에 걸리는 성질의 상당수가 PTM이다. 당쇄의 푸코스 비율, 산성 변이체의 양, 메티오닌 산화율이 그렇다.
공정엔지니어링 직무는 이 특성을 만드는 공정 인자를 다룬다. 배양 온도, pH, 용존산소, 배지와 공급액의 조성, 배양 기간, 정제 단계의 pH와 체류 시간이 여기에 해당한다. 어떤 인자가 어떤 특성을 얼마나 움직이는지 알아야 핵심공정변수 (CPP)를 정할 수 있고, 기술이전에서 규모가 달라졌을 때 무엇을 먼저 확인해야 하는지 알 수 있다. PTM은 이 직무에서 공정 인자와 제품 품질을 잇는 연결 고리다.
항체에서 나타나는 변형의 갈래
유럽 의약품청의 단일클론항체 가이드라인은 항체의 불균일성 원인으로 “C-말단 라이신 처리, N-말단 피로글루탐산, 탈아미드화, 산화, 이성질화, 절단, 이황화결합 불일치, N-결합 올리고당, 글리케이션”을 나열한다. 이 목록을 어디에서 생기는지와 무엇을 바꾸는지로 다시 정리하면 아래 표가 된다.
Table 1. 항체의약품의 주요 PTM
| 변형 | 위치 | 주로 생기는 곳 | 전하 변화 | 보는 시험 |
| N-당쇄 | 중쇄 CH2의 Asn297 | 배양 (세포 안) | 시알산이 붙으면 산성 | 유리 당쇄 HILIC, 펩타이드 맵핑 |
| 탈아미드화 | Asn (특히 Asn-Gly 서열) | 배양 후반, 정제, 보관 | 산성 | icIEF, 펩타이드 맵핑 |
| C-말단 라이신 | 중쇄 C-말단 | 배양 (효소 절단의 정도) | 남아 있으면 염기성 | icIEF, CEX |
| N-말단 피로글루탐산 | 중쇄·경쇄 N-말단 Gln/Glu | 배양, 보관 | Gln에서 생기면 산성 쪽 | icIEF, 펩타이드 맵핑 |
| 글리케이션 | Lys 측쇄 | 배양 (배지의 포도당) | 산성 | icIEF, 온전 질량 분석 |
| 산화 | Fc의 Met252·Met428, CDR의 Met·Trp | 정제, 보관 (빛, 금속, 과산화물) | 형식전하 변화 없음 (산성 쪽에 섞여 나올 수 있음) | 펩타이드 맵핑 |
| 이황화결합 변이 | 힌지, 사슬 간 결합 | 배양, 보관 | 거의 없음 | 비환원 CE-SDS, 펩타이드 맵핑 |
| 절단 | 힌지 부근 | 보관, 낮은 pH | — | CE-SDS, SEC |
표에서 보이는 것이 두 가지다. 첫째, 변형마다 생기는 곳이 다르다. 당쇄와 C-말단 라이신은 세포 안에서 결정되고, 산화와 절단은 세포를 떠난 뒤에 주로 생긴다. 둘째, 전하를 바꾸는 변형과 바꾸지 않는 변형이 나뉜다. 이 구분이 분석법의 선택을 정한다. 전하가 바뀌는 변형은 등전점 전기영동 하나로 한꺼번에 볼 수 있지만, 산화처럼 전하가 거의 바뀌지 않는 변형은 펩타이드 맵핑으로 잘라서 보아야 한다.
그림 1. IgG 위의 PTM 위치
N-당쇄
Asn297의 두갈래 당쇄
IgG의 중쇄는 CH2 도메인의 297번 아스파라긴 (EU 번호 기준)에 N-결합 당쇄를 하나씩 가진다. 두 중쇄이므로 항체 한 분자에 두 개다. CHO 세포에서 만든 항체의 당쇄는 대부분 “두갈래 복합형”이다. 안쪽에 N-아세틸글루코사민 두 개와 만노스 세 개로 된 공통 뼈대가 있고, 그 위로 두 갈래가 뻗어 각 갈래 끝에 N-아세틸글루코사민이 붙는다. 여기까지가 G0이다. 갈래 끝에 갈락토스가 하나 붙으면 G1, 둘 다 붙으면 G2다. 뼈대의 첫 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 붙어 있으면 이름 끝에 F가 붙어 G0F, G1F, G2F가 된다.
CHO에서 만든 IgG는 G0F와 G1F가 대부분을 차지하고 G2F가 그 뒤를 따른다. 한 문헌의 예시에서는 G0F 35.5%, G1F 43.4%, G2F 9.5%였다. 나머지는 갈래가 다 만들어지지 못한 고만노스형 (Man5 등), 푸코스가 없는 형, 갈락토스 끝에 시알산이 붙은 형이다. 유럽 의약품청 가이드라인이 “주요 당쇄 구조 (흔히 G0, G1, G2)의 분포를 결정해야 한다”고 한 것이 이 분포다.
그림 2. Asn297 두갈래 당쇄의 구조와 주요 당형
당쇄가 기능을 바꾸는 경로
Fc 당쇄는 항원과 결합하는 부위에 있지 않다 (일부 항체는 Fab에도 당쇄를 가지며, 뒤에 나오는 세툭시맙의 α-1,3-갈락토스가 그 예다). 그런데도 핵심품질특성이 되는 이유는 Fc의 기능을 바꾸기 때문이다. 어느 당이 있고 없는지에 따라 달라지는 기능이 다르다.
Table 2. Fc 당쇄의 구성 요소와 기능
| 당쇄 요소 | 바뀌는 기능 | 방향 | 핵심품질특성 여부 |
| 핵심 푸코스 | FcγRIIIa 결합, ADCC | 푸코스가 없으면 FcγRIIIa 결합이 최대 50배까지 세지고 (Shields 2002) ADCC가 크게 올라감 | ADCC가 작용기전이면 거의 항상 |
| 갈락토스 | C1q 결합, CDC | 갈락토스가 많으면 CDC 상승 | CDC가 작용기전이면 |
| 고만노스 (Man5 등) | 혈중 청소 속도 | 만노스 수용체로 먼저 제거됨 (전체 노출량에 미치는 크기는 양에 따라 다름) | 양이 많으면 약동학 관점에서 |
| 시알산 | 항염증 활성, ADCC | 시알산이 붙으면 ADCC가 낮아질 수 있음. 치료용 항체에서는 양이 매우 적음 | 유의한 양이고 ADCC가 작용기전이면 |
| NGNA (사람에게 없는 시알산) | 면역원성 | 사람은 대부분 항NGNA 항체를 가지며 역가는 개인차가 큼 | 대개 해당 |
| α-1,3-갈락토스 | 면역원성 (과민반응) | 쥐 골수종 세포주 (SP2/0, NS0)에서 생김. CHO는 거의 만들지 않으나 미량 검출 사례 있음 | 쥐 세포주 사용 시 |
표의 첫 줄이 가장 중요하다. 핵심 푸코스가 없는 당쇄는 FcγRIIIa에 더 세게 붙고, 그 결과 항체의존세포독성 (ADCC)이 크게 올라간다. 원 논문은 푸코스가 없는 IgG1의 FcγRIIIa 결합이 최대 50배까지 좋아졌고 그에 따라 세포독성이 강해졌다고 보고했다. 50배라는 숫자는 수용체 결합의 값이지 ADCC 자체의 값이 아니다. 리뷰 논문 가운데는 이를 “ADCC 50배”로 옮겨 적은 것도 있으므로, 숫자를 말할 때는 결합인지 ADCC인지를 밝히는 편이 안전하다. 그래서 암 항체처럼 ADCC가 작용기전인 제품에서는 비푸코스 비율이 배치마다 같아야 하고, 이 비율을 올리려고 푸코스 전이효소를 없앤 세포주를 쓰기도 한다. 반대로 ADCC가 필요 없는 제품에서는 비푸코스 비율이 뜻하지 않게 올라가면 안 된다.
고만노스형은 다른 이유로 관리한다. Man5 같은 고만노스 당쇄를 가진 항체는 만노스 수용체를 거쳐 혈중에서 선택적으로 빨리 제거된다. 투여 경로와 무관하게 Man5형이 먼저 사라진다는 보고가 있다. 즉 고만노스형이 많은 배치는 같은 용량을 넣어도 그 분획이 먼저 사라진다. 다만 전체 노출량에 미치는 크기는 고만노스의 양에 따라 다르고, 통상 수준에서는 영향이 크지 않았다는 보고도 있다. 유럽 의약품청 가이드라인이 “당쇄는 약동학에 영향을 줄 수 있고 면역원성을 조절할 수 있으므로 적절한 판정기준을 고려해야 한다”고 적은 것은 이런 관찰에 근거한다.
면역원성 항목은 세포주 선택과 직결된다. 쥐 골수종 세포주 (SP2/0, NS0)로 만든 항체에는 사람에게 없는 α-1,3-갈락토스가 붙는다. 세툭시맙에서는 이 구조가 Fab의 당쇄에 있었고, 여기에 대한 IgE를 미리 가진 환자에게서 과민반응이 보고되었다. CHO 세포는 이 구조를 거의 만들지 않아 위험이 훨씬 낮다. 다만 CHO에도 해당 전이효소의 상동 유전자가 있어 미량의 α-1,3-갈락토스가 생길 수 있고, CHO로 만든 제품에서 실제로 검출된 사례가 보고되어 있다. 다만 온전한 Fc에 붙은 α-1,3-갈락토스에는 환자의 IgE가 잘 붙지 않는다는 후속 보고가 있어, 위험의 크기는 그 구조가 Fab에 있는지 Fc에 있는지에 따라 다르다. 그래서 “CHO는 만들지 못한다”가 아니라 “CHO에서는 수준을 확인한다”가 정확한 말이다.
배양 인자가 당쇄를 움직이는 경로
여기서 두 번째 궁금증에 답할 수 있다. 당쇄는 골지체의 효소가 뉴클레오티드 당을 기질로 써서 한 개씩 붙이는 결과물이므로, 효소의 활성과 기질의 공급을 바꾸는 배양 인자는 무엇이든 당쇄를 바꾼다.
갈락토스화가 가장 분명한 예다. 갈락토스를 붙이는 효소는 UDP-갈락토스를 기질로 쓰고 망간을 보조인자로 쓴다. 그래서 배지나 공급액에 갈락토스, 우리딘 (UDP의 재료), 망간을 넣으면 갈락토스화가 올라간다. 한 문헌은 “갈락토스화 전구체인 갈락토스와 우리딘, 그리고 갈락토스 전이효소의 보조인자인 망간의 양을 조절해 갈락토스화를 조절할 수 있다”고 정리한다. 공정엔지니어가 갈락토스화를 목표 범위로 맞출 때 실제로 쓰는 손잡이가 이것이다. 다만 망간은 포도당이 부족한 구간에서 고만노스형을 함께 올릴 수 있다는 보고가 있으므로, 갈락토스화와 고만노스는 같이 놓고 본다.
암모니아는 반대 방향으로 작동한다. 배양이 진행되면서 글루타민 대사와 세포 사멸로 암모니아가 쌓이면 시알산화가 떨어지는 것이 여러 연구에서 보고되었다. 암모니아가 골지체 안의 pH를 올려 시알산 전이효소를 비롯한 글리코실 전이효소가 제자리를 벗어나게 한다는 설명과, 뉴클레오티드 당의 풀을 바꾼다는 설명이 함께 제시되어 있다. 이 효과는 적혈구생성인자처럼 시알산이 많은 당단백질에서 특히 뚜렷하고, IgG의 Fc 당쇄는 원래 시알산이 적어서 크게 드러나지 않는 경우가 많다. 그래도 암모니아를 낮추는 배지 설계 (글루타민 대체, 공급 전략)는 세포 성장만이 아니라 당쇄 관리이기도 하다.
고만노스형은 당쇄가 다 만들어지기 전에 세포 밖으로 나온 결과다. 골지체를 지나는 시간이 짧거나 만노스를 잘라내는 효소가 따라가지 못하면 늘어난다. 한 문헌은 “온도, pH, 삼투압 같은 배양 조건도 고만노스 같은 당쇄의 양에 영향을 줄 수 있다”고 적는다. 배양 후반에 온도를 낮추는 조작, 공급으로 삼투압이 올라가는 것, 배양을 며칠 더 끌고 가는 결정이 모두 고만노스 비율에 흔적을 남긴다. 서두의 첫 질문 “온도를 낮추면 생산성 외에 무엇이 달라지는가”에는 이렇게 답할 수 있다. 생산성과 함께 당쇄 분포가 달라지고, 그 방향과 크기는 세포주와 공정마다 달라서 실측으로 확인해야 한다.
그림 3. 배양 인자와 당쇄 분포의 연결
예제) 어느 항체의 유리 당쇄 분석 결과가 G0F 40%, G1F 45%, G2F 10%, Man5 3%, 그 밖의 형 2%였다. 두 갈래 가운데 갈락토스가 붙은 갈래의 비율 (갈락토스화율)은 얼마인가?
G1F는 두 갈래 가운데 한쪽에, G2F는 양쪽에 갈락토스가 있다. 갈락토스가 붙은 갈래 수는 45 × 1 + 10 × 2 = 65다. 분모는 두갈래 복합형만 센다. Man5는 갈래가 아예 만들어지지 않은 형이므로 갈래 수에 넣을 수 없다. 그 밖의 형 2%는 조성이 주어지지 않았으므로 여기서는 G0F·G1F·G2F만으로 계산한다. 복합형은 95%, 갈래 수는 190이고, 갈락토스화율은 65 ÷ 190 ≒ 34.2%다. 실제 자료에서 시알산이 붙은 형이 있다면 그 형은 이미 갈락토스를 가지고 있으므로 분자에도 넣어야 한다. 한 가지 기억할 것은 이 값이 “G1F + G2F = 55%”와도, 분모를 전체 당쇄 200갈래로 잡은 32.5%와도 다르다는 점이다. 앞은 갈래 단위, 뒤는 분자 단위이고, 분모에 무엇을 넣는지에 따라서도 달라진다. 어느 정의를 쓰는지 밝히지 않고 숫자만 말하면 서로 다른 값을 놓고 다투게 된다.
전하 변이체
당쇄 다음으로 자주 나오는 것이 전하 변이체다. 항체를 등전점 전기영동에 걸면 주 봉우리 양쪽으로 산성 봉우리와 염기성 봉우리가 나타난다. 어느 변형이 어느 쪽 봉우리를 만드는지 알면 봉우리의 변화에서 공정의 변화를 읽을 수 있다.
Table 3. 전하 변이체를 만드는 변형
| 봉우리 | 변형 | 전하가 바뀌는 이유 |
| 산성 | 탈아미드화 | 중성인 Asn이 음전하를 띤 Asp 또는 isoAsp로 바뀜 |
| 산성 | 글리케이션 | 양전하를 띤 Lys 측쇄에 포도당이 붙어 양전하가 줄어듦 |
| 산성 | 시알산화 | 음전하를 띤 시알산이 당쇄 끝에 붙음 |
| 산성 | 트리설파이드 | 이황화결합에 황이 하나 더 끼어듦 (산성 쪽으로 보고됨) |
| 염기성 | C-말단 라이신 잔존 | 양전하를 띤 Lys이 남아 있음 |
| 염기성 | 숙신이미드 중간체 | Asp 이성질화 과정의 고리 구조가 카복실기의 음전하를 잃음 (Asn 탈아미드화 경로의 숙신이미드는 전하 변화가 거의 없음) |
| 염기성 | C-말단 아미드화 | C-말단 카복실기의 음전하가 사라짐 |
탈아미드화와 이소아스파르트산
탈아미드화는 아스파라긴 측쇄의 아미드가 떨어져 나가 아스파르트산이 되는 반응이다. 중간에 다섯 원자 고리인 숙신이미드가 생기고, 이 고리가 열릴 때 정상적인 아스파르트산과 곁가지가 뒤틀린 이소아스파르트산이 함께 나온다. Asn 뒤에 글리신이 오는 서열에서 특히 빠르고, pH가 높고 온도가 높을수록 빨라진다. 그래서 배양 후반 (pH가 중성 부근으로 유지되고 분비된 항체가 며칠씩 배양 온도에 머무는 구간), 정제 중 높은 pH의 완충액에 머무는 시간, 그리고 보관 기간이 모두 탈아미드화의 원인이 된다.
아스파르트산에서도 같은 고리가 생길 수 있는데 (이성질화), 이때는 카복실기의 음전하가 사라져 염기성 변이체로 나타난다.
탈아미드화가 어디에서 일어나는지가 중요하다. Fc의 보존된 아스파라긴에서 일어나면 기능에 미치는 영향이 대개 작다. 그러나 상보성결정부위 (CDR)의 아스파라긴에서 일어나면 항원 결합이 떨어져 역가가 내려간다. 그래서 같은 “산성 변이체 3% 증가”라도 어느 잔기에서 왔는지를 펩타이드 맵핑으로 확인해야 핵심품질특성인지 판단할 수 있다.
C-말단 라이신
IgG 중쇄의 유전자는 C-말단이 라이신으로 끝나도록 되어 있다. 그런데 세포가 항체를 분비하는 과정에서 카복시펩티다제 (CHO에서는 카복시펩티다제 D)가 이 라이신을 잘라낸다. 잘리는 정도가 분자마다 달라서 라이신이 둘 다 남은 것 (K2), 하나만 남은 것 (K1), 둘 다 잘린 것 (K0)이 섞여 나오고, 남은 라이신은 양전하를 띠므로 염기성 봉우리를 만든다.
이 변이체는 사람 몸에 들어가면 곧 잘려 나간다. 한 연구는 체내에서 남은 라이신이 제거되는 반감기를 한 시간 남짓으로 보고했다. 사람 IgG의 C-말단 라이신은 체내에서 카복시펩티다제에 의해 대개 제거되므로, 제품에 남아 있는 라이신은 투여 뒤 오래 가지 않는다. 그래서 C-말단 라이신은 안전성이나 유효성보다 공정 일관성의 지표로 보는 경우가 많다. 다만 라이신이 남아 있는 항체는 보체의존세포독성이 약해진다는 보고가 있으므로, CDC가 작용기전인 제품에서는 따로 평가한다. 분석할 때는 카복시펩티다제 B를 미리 처리해 라이신을 다 잘라낸 뒤 나머지 전하 변이체를 보는 방법을 흔히 쓴다.
N-말단 피로글루탐산
중쇄나 경쇄의 N-말단이 글루타민이면, 말단 아미노기가 측쇄와 고리를 이루어 피로글루탐산이 된다. 이 반응은 효소 없이도 진행되고 대부분의 분자에서 거의 완전히 일어난다. N-말단이 글루탐산이어도 같은 고리가 생기지만 훨씬 느리다. 글루타민에서 피로글루탐산이 되면 양전하를 띠던 말단 아미노기가 사라지므로 전하가 산성 쪽으로 움직이고, 변환이 덜 된 분자와 다 된 분자가 전하 변이체 분석에서 다른 봉우리로 나타난다. 기능에 미치는 영향은 대개 작지만, 배치마다 변환 정도가 다르면 전하 프로파일이 흔들리므로 원인을 알고 있어야 한다.
글리케이션
글리케이션은 배지의 포도당이 라이신 측쇄의 아미노기와 효소 없이 반응해 붙는 것이다. 당쇄 (glycosylation)와 이름이 비슷하지만 효소가 관여하지 않고, 붙는 위치도 정해져 있지 않으며, 항체 표면의 여러 라이신에 흩어져 붙는다. 한 문헌은 이것을 “항체 생산 중 배양액의 포도당에 노출되어 생기는 흔한 산성 변이체”라고 정리한다. 포도당 농도가 높고 배양이 길수록 늘어나므로, 포도당을 높게 유지하는 공급 전략은 글리케이션을 대가로 치른다. 여러 부위에 흩어져 붙은 글리케이션은 역가에 영향을 줄 위험이 낮다는 보고가 있지만, 그 판단은 제품마다 자료로 뒷받침해야 한다.
전하 변이체를 보는 방법
전하 변이체는 두 가지 방법으로 본다. 영상화 모세관 등전점 전기영동 (icIEF)은 분자의 등전점, 즉 순전하에 근거해 분리하므로 전하 변화 자체를 본다. 양이온교환 크로마토그래피 (CEX)는 전하와 함께 표면 구조의 영향을 받지만 분취가 가능해서 어느 봉우리가 무엇인지 잡아내어 확인할 수 있다. 실무에서는 icIEF로 매 배치의 프로파일을 보고, 프로파일이 달라졌을 때 CEX로 분취해 펩타이드 맵핑으로 원인을 찾는다.
그림 4. 전하 변이체 프로파일과 봉우리의 원인
산화
산화는 세포를 떠난 뒤에 주로 생기는 변형이다. 한 문헌은 “단백질 산화는 생산 공정 중 불순물로 존재하는 금속 이온과 과산화물에 의해 촉발되거나 빛에 의해 일어날 수 있다”고 정리한다. 정제 완충액의 금속 이온, 폴리소르베이트 같은 부형제가 분해되며 생기는 과산화물, 그리고 충전과 검사 중의 빛 노출이 원인이다. 그래서 산화는 배양보다 정제와 보관, 즉 공정 후반의 관리 항목이다.
Fc에서 산화되기 쉬운 잔기는 CH2의 Met252와 CH3의 Met428이다. 이 두 메티오닌은 신생아 Fc 수용체 (FcRn)가 붙는 면에 있어서, 산화되면 FcRn 결합이 약해지고 혈중 반감기가 짧아질 수 있다. 두 잔기 가운데 “Met252 산화가 Met428 산화보다 FcRn 결합을 더 크게 손상시킨다”는 보고가 있다. 상보성결정부위의 메티오닌이나 트립토판이 산화되면 문제가 다르다. 항원 결합 자체가 떨어져 “표적 결합이 감소하거나 아예 사라진” 사례가 보고되어 있다.
산화는 형식전하를 바꾸지 않아 전하 분석에서 독립된 봉우리로 잘 잡히지 않는다. 겉보기 등전점이 조금 움직여 산성 봉우리에 섞여 나오는 경우는 있지만, 그것만으로는 산화인지 알 수 없다. 펩타이드 맵핑으로 잘라서 질량 변화 (Met은 +16, Trp은 +4·+16·+32)를 보아야 하고, Fc 산화는 Protein A 결합이 약해지는 성질을 이용해 분석용 Protein A 크로마토그래피로 정도를 빠르게 가늠하기도 한다.
그 밖의 변형
이황화결합 변이는 사슬을 잇는 결합이 정상과 다르게 맺어진 것이다. 결합이 되지 않고 남은 자유 티올, 황이 하나 더 끼어든 트리설파이드, 짝이 바뀐 결합이 있다. 비환원 CE-SDS에서 사슬이 덜 조립된 형태로 나타나거나 펩타이드 맵핑에서 잡힌다. 절단은 힌지 부근에서 펩타이드 결합이 끊어지는 것으로, 낮은 pH와 보관 기간이 원인이고 CE-SDS와 크기배제 크로마토그래피에서 작은 조각으로 보인다. 응집체는 PTM이 아니라 분자 사이의 결합이지만, 앞의 변형들 (특히 산화와 탈아미드화)이 응집을 부추기므로 함께 본다.
핵심품질특성의 판단
여기서 세 번째 궁금증에 답할 수 있다. 변형이 있다는 것과 그 변형이 핵심품질특성이라는 것은 다르다. ICH Q6B는 제조나 보관 중에 생긴 분자 변이체 가운데 활성이 있고 안전성과 유효성에 유해한 영향이 없으며 목적물과 견줄 만한 성질을 가진 것을 “제품관련물질”로, 그렇지 못한 것을 “제품관련불순물”로 나눈다. 같은 종류의 변형이라도 어느 쪽에 들어가는지는 제품마다 다르다.
당쇄를 예로 들면 갈림길이 분명하다. ADCC가 작용기전인 항체에서 비푸코스 비율은 거의 항상 핵심품질특성이다. 그러나 ADCC와 무관하게 표적을 막기만 하는 항체에서는 같은 비푸코스 비율이 훨씬 덜 중요하다. 갈락토스화는 CDC가 작용기전일 때 핵심품질특성이 되고, 고만노스형은 양이 많을 때 약동학 관점에서 핵심품질특성이 된다. 전하 변이체도 같다. 상보성결정부위의 탈아미드화는 역가를 떨어뜨리므로 핵심품질특성이고, Fc의 탈아미드화나 C-말단 라이신은 대개 공정 일관성의 지표에 머문다.
한 가지 기억할 것은, 그래서 “이 변형은 핵심품질특성인가”라는 질문에 변형의 이름만으로 답할 수 없다는 점이다. 그 제품의 작용기전과, 그 변형이 활성·안전성·약동학에 미치는 영향을 자료로 확인한 뒤에야 답이 나온다. 이 판단의 틀은 출하시험(QC) 완전정복 편에서 Q6B의 성분 분류로 다루었다.
예제) 어느 항체의 전하 변이체 프로파일에서 산성 봉우리가 배양 12일차 수확 배치에서 18%, 같은 조건의 16일차 수확 배치에서 24%였다. 펩타이드 맵핑에서 늘어난 산성 종의 대부분이 Fc의 아스파라긴 탈아미드화였다면 어떻게 판단하는가?
산성 봉우리 6%p 증가의 원인이 배양 기간에 따른 탈아미드화라는 것까지가 공정의 해석이다. 그다음은 위치다. Fc의 보존된 아스파라긴 탈아미드화는 역가에 미치는 영향이 대개 작으므로, 이 항체에서 해당 변이체가 제품관련물질로 분류되어 있고 24%가 판정기준 안이라면 배치는 문제가 없다. 다만 배양 기간이 산성 변이체를 움직인다는 사실은 확인된 것이므로, 수확 시점은 핵심공정변수 후보로 올려 두고 관리 범위를 정해야 한다. 같은 6%p라도 늘어난 종이 상보성결정부위의 탈아미드화였다면 역가 시험 결과부터 확인하는 것이 순서다.
공정 인자와 변형의 연결
지금까지의 내용을 공정엔지니어의 관점에서 다시 정리하면 아래 표가 된다. 어떤 인자를 만졌을 때 어느 변형이 움직이고, 그것을 어떤 시험으로 확인하는지의 연결이다.
Table 4. 공정 인자, 움직이는 변형, 확인하는 시험
| 공정 인자 | 움직이는 변형 | 확인하는 시험 |
| 배지·공급액의 갈락토스, 우리딘, 망간 | 갈락토스화 | 유리 당쇄 HILIC |
| 암모니아 축적 (글루타민 대사, 세포 사멸) | 시알산화 감소 (시알산이 많은 당단백질에서 뚜렷) | 유리 당쇄 HILIC, icIEF |
| 배양 온도, pH, 삼투압, 배양 기간 | 고만노스형, 탈아미드화 | 유리 당쇄 HILIC, icIEF, 펩타이드 맵핑 |
| 포도당 농도와 노출 시간 | 글리케이션 | icIEF, 온전 질량 분석 |
| 세포주 (푸코스 전이효소 유무) | 비푸코스 비율 | 유리 당쇄 HILIC, ADCC 시험 |
| 정제 완충액의 pH와 체류 시간 | 탈아미드화, 절단 | icIEF, CE-SDS |
| 금속 이온, 과산화물, 빛 노출 | 산화 | 펩타이드 맵핑 |
표를 가로로 읽으면 한 인자가 여러 변형을 동시에 움직인다는 것이 보인다. 배양 기간을 늘리면 역가 (titer)는 오르지만 고만노스형, 탈아미드화, 글리케이션이 함께 늘고 암모니아로 시알산화는 떨어진다. 그래서 수확 시점은 생산성 하나로 정할 수 없고, 이 변형들이 모두 판정기준 안에 머무는 범위에서 정해진다. 공정엔지니어링 직무의 일이 생산성과 품질 특성 사이의 이 균형을 숫자로 잡는 것이다.
기술이전과 규모 확대에서 이 표가 점검 목록이 된다. 규모가 커지면 혼합과 기체 전달이 달라져 용존 이산화탄소와 pH 분포가 바뀌고, 그 결과 같은 세포주와 같은 배지로도 당쇄 분포가 이동할 수 있다. ICH Q5E가 제조 공정 변경 전후의 비교동등성 평가를 요구하는 것도 이 때문이며, 그 평가에서 실제로 비교하는 항목의 상당수가 이 글의 변형들이다. 배양 공정 전체의 흐름은 세포배양(Upstream) 완전정복에서, 정제 단계의 pH 노출은 정제(Downstream) 완전정복에서 다루었다.
면접에서는 이렇게 말한다
전형의 구성과 인성 면접까지 포함한 준비 방법은 삼성바이오로직스 면접 질문 — 삼바 직무 PT·인성면접 준비법에 정리해 두었다. 여기서는 PTM이 직무 PT에서 어떻게 나오는지만 다룬다.
공정엔지니어링 직무 PT는 개념 설명, 상황 적용, 한계와 해결책의 세 문항이 한 덩어리로 이어진다. PTM은 세 문항 모두에 걸리는 주제다. 첫 문항에서 정의를 말하고, 둘째 문항에서 공정 인자와 연결하고, 셋째 문항에서 어느 것이 핵심품질특성인지 판단하는 흐름으로 답하면 된다.
“배양 온도를 낮추면 무엇이 달라지는가”라는 질문에 “생산성이 달라집니다”에서 멈추면 첫 문항의 답이다. “세포 성장이 느려지고 생산 기간이 길어지는 한편, 당쇄 분포와 전하 변이체 분포도 달라질 수 있어서 온도 변경은 생산성과 품질 특성을 함께 보고 정해야 한다고 이해하고 있다”까지 말하면 둘째와 셋째 문항까지 이어진 답이 된다.
Table 5. 예상 꼬리질문과 답의 핵심
| 꼬리질문 | 답의 핵심 |
| PTM이란 | 서열이 완성된 뒤 붙거나 바뀌는 변형. 주형이 없어 세포 상태와 공정 조건에 따라 분포가 달라짐. Q6B는 그 패턴을 정의하고 임상 배치와의 일관성을 입증하라고 요구 |
| 항체의 당쇄는 어디에 있고 왜 중요한가 | 중쇄 CH2의 Asn297. 항원 결합과 무관하지만 Fc 기능 (ADCC, CDC), 청소 속도, 면역원성을 바꿈 |
| 푸코스가 없으면 무엇이 달라지는가 | FcγRIIIa 결합이 세져 ADCC가 크게 오름. ADCC가 작용기전이면 핵심품질특성 |
| 갈락토스화를 올리려면 | 갈락토스, 우리딘, 망간을 배지나 공급액에 보충 |
| 산성 변이체가 늘었다면 무엇부터 보는가 | 탈아미드화, 글리케이션, 시알산화 가운데 무엇인지 펩타이드 맵핑으로 위치를 확인. CDR이면 역가부터 |
| C-말단 라이신은 왜 관리하는가 | 공정 일관성의 지표. 체내에서 곧 잘리므로 대개 안전성·유효성 문제는 아니나, CDC가 작용기전이면 평가 |
| 산화는 어디에서 생기는가 | 주로 정제와 보관. 금속 이온, 과산화물, 빛. Fc의 Met252·Met428은 FcRn 결합, CDR의 Met·Trp는 항원 결합에 영향 |
| 규모를 키웠더니 당쇄가 달라졌다면 | 혼합과 기체 전달 차이로 pCO2·pH 분포가 달라진 것부터 의심. Q5E 비교동등성 평가 대상 |
준비하지 않은 질문을 받았을 때는 아는 데까지 설명하고 배우려는 자세로 되묻는 것이 낫다. “특정 공정에서 어느 인자가 당쇄를 얼마나 움직이는지는 직접 경험하지 못했습니다. 준비하면서 찾아보니 갈락토스와 망간 보충, 암모니아 축적, 온도와 배양 기간이 주된 인자로 정리되어 있었는데, 실제 공정에서는 어느 인자를 먼저 조정하시는지 궁금합니다.” 모르는 것을 질문으로 바꾸어 두면 준비한 범위가 그대로 전달된다.
삼성바이오로직스 직무 PT의 기출 유형 가운데 그래프 해석형과 트러블슈팅형이 이 주제와 자주 맞물린다. 배양 프로파일을 주고 “이 조건에서 제품 품질은 어떻게 달라지겠는가”를 묻거나, 전하 변이체 프로파일이 배치마다 달라진 상황을 주고 원인과 대응을 고르게 하는 형태다. 앞의 Table 4를 공정 인자에서 시험 항목으로 한 번, 시험 항목에서 공정 인자로 한 번 읽어 두면 두 방향 모두에 답할 수 있다.
[개념 요약]
PTM (post-translational modification): 아미노산 서열이 완성된 뒤 일어나는 변형. 주형이 없어 효소 활성, 기질 공급, 골지체 pH, 통과 시간에 따라 분포가 달라짐. Q6B는 패턴을 정의하고 임상 배치와의 일관성을 입증하도록 요구
변형의 갈래: N-당쇄 (Asn297), 탈아미드화 (Asn→Asp/isoAsp, 산성), C-말단 라이신 (염기성), N-말단 피로글루탐산, 글리케이션 (Lys + 포도당, 산성), 산화 (Met252·Met428, CDR Met·Trp), 이황화결합 변이, 절단
생기는 곳: 당쇄·C-말단 라이신은 세포 안. 탈아미드화는 배양 후반·정제·보관. 글리케이션은 배양. 산화는 정제·보관 (금속, 과산화물, 빛). 절단은 낮은 pH·보관
당쇄와 기능: 비푸코스 → FcγRIIIa 결합 최대 50배 상승, ADCC 상승. 갈락토스 → CDC 상승. 고만노스 → 빠른 청소. 시알산 → ADCC 저하 가능 (양은 적음). NGNA·α-1,3-Gal → 면역원성 (α-Gal은 쥐 세포주에서 주로 생기고 CHO에서는 미량)
배양 인자와 당쇄: 갈락토스·우리딘·망간 → 갈락토스화 상승. 암모니아 → 시알산화 감소. 온도·pH·삼투압·배양 기간 → 고만노스 변화. 세포주 → 푸코스
전하 변이체: 산성 = 탈아미드화, 글리케이션, 시알산화, 트리설파이드. 염기성 = C-말단 라이신, 숙신이미드, C-말단 아미드화. icIEF로 프로파일, CEX 분취 + 펩타이드 맵핑으로 원인
핵심품질특성 판단: 변형의 이름이 아니라 작용기전과 영향 자료로 결정. CDR 탈아미드화·비푸코스 (ADCC 제품)·고만노스 (다량)는 대개 해당. Fc 탈아미드화·C-말단 라이신은 대개 공정 일관성 지표
공정엔지니어의 일: 한 인자가 여러 변형을 함께 움직임. 수확 시점은 생산성과 변형들의 판정기준을 함께 놓고 정함. 규모 확대·기술이전 시 Q5E 비교동등성으로 확인
자주 묻는 질문
PTM이 무엇인가
post-translational modification의 약자다. 리보솜에서 아미노산 서열이 완성된 뒤에 당이 붙거나, 잔기가 잘리거나, 화학적으로 바뀌는 것을 모두 가리킨다. 항체의약품에서는 N-당쇄, 탈아미드화, C-말단 라이신, 피로글루탐산, 글리케이션, 산화, 이황화결합 변이가 대표적이다.
항체 당쇄는 어디에 붙는가
중쇄 CH2 도메인의 297번 아스파라긴에 붙는다. 항체 한 분자에 두 개다. CHO 세포에서 만든 항체의 당쇄는 대부분 두갈래 복합형이며 G0F, G1F, G2F가 주를 이룬다.
비푸코스 항체는 왜 ADCC가 높은가
핵심 푸코스가 없으면 Fc가 FcγRIIIa에 더 세게 붙기 때문이다. 푸코스가 없는 IgG1의 FcγRIIIa 결합이 최대 50배까지 좋아졌다는 보고가 있고, 그 결과 ADCC가 크게 오른다.
전하 변이체는 무엇으로 보는가
영상화 모세관 등전점 전기영동 (icIEF)과 양이온교환 크로마토그래피 (CEX)로 본다. icIEF는 등전점 (순전하) 차이로 분리하고, CEX는 분취가 가능해 봉우리의 원인을 펩타이드 맵핑으로 확인할 때 쓴다.
삼성바이오로직스 직무 PT 면접에 PTM이 나오는가
공정엔지니어링·MSAT·품질 직무에서 나올 수 있는 주제다. 직무 PT는 개념 설명, 상황 적용, 한계와 해결책의 세 문항이 이어지는 형태여서, 당쇄나 전하 변이체처럼 공정 인자와 품질 특성이 함께 걸리는 주제가 세 문항을 만들기에 적합하기 때문이다. 전형 구성과 준비 방법은 삼성바이오로직스 면접 질문 편을 참고하면 된다.
PTM은 모두 핵심품질특성인가
아니다. 그 제품의 작용기전과, 변형이 활성·안전성·약동학에 미치는 영향을 자료로 확인해 정한다. ADCC가 작용기전인 항체의 비푸코스 비율, 상보성결정부위의 탈아미드화는 대개 해당하고, C-말단 라이신은 대개 공정 일관성의 지표에 머문다.
참고자료
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