이 가이드라인의 목적은 (1) 면역독성을 나타낼 가능성이 있는 화합물을 확인하기 위한 비임상시험 접근법에 대한 권고사항과 (2) 면역독성시험에 대한 증거 가중(weight of evidence) 기반 의사결정 접근법에 대한 지침을 제공하는 것이다. 이 가이드라인에서 면역독성은 의도하지 않은 면역억제 또는 면역증강으로 정의한다. 약물 유발 과민반응과 자가면역은 제외한다.

The objectives of this guideline are to provide (1) recommendations on nonclinical testing approaches to identify compounds which have the potential to be immunotoxic, and (2) guidance on a weight-of-evidence decision making approach for immunotoxicity testing. Immunotoxicity is, for the purpose of this guideline, defined as unintended immunosuppression or enhancement. Drug-induced hypersensitivity and autoimmunity are excluded.

사람용 의약품이 면역계에 미칠 수 있는 유해 영향의 평가는 표준 의약품 개발 과정에 포함되어야 한다. 면역계에 대한 독성은 다양한 유해 영향을 포괄한다. 여기에는 면역반응의 억제 또는 증강이 포함된다. 면역반응의 억제는 감염원 또는 종양세포에 대한 숙주 저항성 감소로 이어질 수 있다. 면역반응의 증강은 자가면역질환 또는 과민반응을 악화시킬 수 있다. 약물 또는 약물-단백질 부가물이 이물질로 인식되어 항약물 반응을 자극할 수도 있다. 이후 약물에 다시 노출되면 과민(알레르기) 반응이 나타날 수 있다. 과거의 과학적 연구와 시험법 개발 및 밸리데이션 노력은 대부분 의약품 개발 후보물질의 면역억제 또는 접촉감작 가능성 평가에 집중되었다.

Evaluation of potential adverse effects of human pharmaceuticals on the immune system should be incorporated into standard drug development. Toxicity to the immune system encompasses a variety of adverse effects. These include suppression or enhancement of the immune response. Suppression of the immune response can lead to decreased host resistance to infectious agents or tumor cells. Enhancing the immune response can exaggerate autoimmune diseases or hypersensitivity. Drug or drug-protein adducts might also be recognized as foreign and stimulate an anti-drug response. Subsequent exposures to the drug can lead to hypersensitivity (allergic) reactions. Much of the science and method development and validation efforts in the past have been focused on evaluating drug development candidates for their potential for either immunosuppression or contact sensitization.

현재 사람용 의약품의 호흡기 또는 전신 알레르기성(항원성)이나 약물 특이적 자가면역을 시험하기 위한 표준 접근법은 없으며, 이러한 평가변수에 대한 시험은 현재 어느 지역에서도 요구되지 않는다. 피부감작 시험 접근법에는 지역 간 차이가 없다.

No standard approaches for human pharmaceuticals are currently available for testing for respiratory or systemic allergenicity (antigenicity) or drug-specific autoimmunity; testing for these endpoints is not currently required in any region. There are no regional differences in testing approaches of skin sensitization.

면역억제 또는 면역증강은 다음 두 가지 서로 다른 군과 관련될 수 있다.

Immunosuppression or enhancement can be associated with two distinct groups:

암 치료에 사용하는 항증식제는 의도하지 않은 면역억제를 일으키는 약물의 예이다. 이러한 경우 비임상시험의 유해 소견은 비교적 직접적으로 사람에서의 면역독성을 예측한다. 즉, 표적 조직이 대개 골수 유래 면역계 전구세포와 같이 빠르게 분열하는 세포 유형이므로, 면역독성을 확인하기 위한 특정 시험은 의약품 위해성 평가에서 큰 가치가 없을 것이다. 따라서 면역기능에 대한 유해 영향은 약리 활성에 근거하여 예측할 수 있으며, 대개 비임상시험에서 신뢰성 있게 평가할 수 있다. 면역반응을 억제하도록 의도되지 않은 다른 유형의 화합물에서는 과장된 약력학 작용과 비표적 영향의 구분이 덜 명확할 수 있다. 예를 들어, 일부 항염증 화합물은 특정 선천면역 기능에 영향을 미치지만 반드시 적응면역반응에 영향을 미치지는 않는다.

Anti-proliferative agents used to treat cancer are an example of drugs that produce unintended immunosuppression. In such instances, adverse findings in nonclinical studies are predictive of human immunotoxicity in a rather straightforward manner. That is, specific assays to determine immunotoxicity are probably not valuable in drug risk assessment since the target tissues are usually rapidly dividing cell types, such as bone marrow-derived immune system progenitor cells. Hence, the adverse effects on immune function can be predicted based on pharmacologic activity and can usually be reliably evaluated in non-clinical studies. For other types of compounds not intended to suppress the immune response, distinction between exaggerated pharmacodynamics and non-target effects can be less obvious. As an example, some anti-inflammatory compounds have an effect on certain innate immune functions but do not necessarily affect the adaptive immune response.

이 가이드라인은 사람용 의약품으로 유발되는 면역독성에 대한 비임상시험 권고사항을 제공하는 데 중점을 둔다. 이 가이드라인은 의도하지 않은 면역억제 및 면역증강에 한정하며, 알레르기성 또는 약물 특이적 자가면역은 제외한다.

This guideline is focused on providing recommendations on nonclinical testing for immunotoxicity induced by human pharmaceuticals. It is restricted to unintended immunosuppression and immunoenhancement, excluding allergenicity or drug-specific autoimmunity.

이 가이드라인은 사람에게 사용하도록 의도된 새로운 의약품에 적용되며, 시판 중인 의약품으로서 다른 적응증이나 현행 제품 표시사항의 그 밖의 변경이 제안되어 그 변경으로 다루어지지 않은 관련 면역독성 문제가 생길 수 있는 경우에도 적용된다. 또한 이 가이드라인은 임상시험 중 및 시판 승인 후 면역독성의 임상 징후가 관찰된 약물에도 적용될 수 있다. 이 가이드라인은 ICH S6 가이드라인¹이 다루는 생명공학 유래 의약품과 그 밖의 생물의약품에는 적용되지 않는다. 감작 또는 과민반응에 관한 기존 지침 문서는 계속 유효하며 이 문서의 영향을 받지 않는다. 각 면역독성시험을 수행하는 방법에 대한 구체적인 지침을 제공하는 것은 이 가이드라인의 범위를 벗어난다. 일반적인 시험방법 지침은 부록에 제시한다.

This guideline applies to new pharmaceuticals intended for use in humans, as well as to marketed pharmaceuticals proposed for different indications or other variations on the current product label in which the change could result in unaddressed and relevant immunotoxicity issues. In addition, the guideline might also apply to drugs for which clinical signs of immunotoxicity are observed during clinical trials and following approval to market. The guideline does not apply to biotechnology-derived pharmaceutical products covered by ICH S6 Guideline¹ and other biologicals. Existing guidance documents on sensitization or hypersensitivity remain in force and are not affected by this document. It is beyond the scope of this guideline to provide specific guidance on how each immunotoxicity study should be performed. General methodology guidance is provided in the Appendix.

이 가이드라인에 적용되는 일반 원칙은 다음과 같다.

The general principles that apply to this guideline are:

이하의 가이드라인 설명은 순서도(그림 1)에 제시한 면역독성 평가의 권장 의사결정 과정을 따른다. 시험방법에 대한 보다 상세한 설명은 부록에 있다.

The description of the guideline below will follow the recommended decision process in immunotoxicity evaluation as shown in the flow diagram (Figure 1). More detailed descriptions of the testing methods are in the Appendix.

추가 면역독성시험을 촉발할 수 있는 고려 요인은 다음 영역에서 확인할 수 있다: (1) STS 소견, (2) 약물의 약리학적 특성, (3) 대상 환자군, (4) 알려진 면역조절제와의 구조적 유사성, (5) 약물의 체내 동태, (6) 임상 정보.

Factors to consider that might prompt additional immunotoxicity studies can be identified in the following areas: (1) findings from STS; (2) the pharmacological properties of the drug; (3) the intended patient population; (4) structural similarities to known immunomodulators; (5) the disposition of the drug; and (6) clinical information.

잠재적 면역독성에 대한 초기 선별은 표준독성시험으로 한다. 초기 단기 시험부터 보다 장기의 반복투여시험에 이르기까지 설치류 및 비설치류 시험의 데이터를 고려하여야 한다. 평가하여야 할 지표와 병리조직학적 소견의 보고에 관한 추가 세부사항은 부록에 제시한다.

The initial screen for potential immunotoxicity involves standard toxicity studies. Data from rodent and non-rodent studies from early short term to more chronic repeat-dose studies should be taken into consideration. Additional details on the parameters that should be evaluated and the reporting of histopathology findings are provided in the Appendix.

STS 데이터는 면역독성 가능성의 징후에 대하여 평가하여야 한다. 고려하여야 할 징후는 다음과 같다.

Data from STS should be evaluated for signs of immunotoxic potential. Signs that should be taken into consideration are the following:

이들 지표의 변화는 면역억제 또는 면역계의 활성화 증강을 반영할 수 있다. 면역억제는 대개 면역 지표 값의 감소로 나타나고, 면역증강은 대개 값의 증가로 나타난다. 그러나 이러한 관계는 절대적이지 않으며 일부 경우에는 반대로 나타날 수 있다.

Changes in these parameters could reflect immunosuppression or enhanced activation of the immune system. Immunosuppression is usually reflected by reduced values of immune parameters, whereas immunoenhancement is usually reflected by increased values. However, these relationships are not absolute and can be inverted in some cases.

다른 장기계 독성의 위해성 평가와 마찬가지로, 면역독성 평가에는 다음이 포함되어야 한다.

Similar to the assessment of risk with toxicities in other organ systems, the assessment of immunotoxicity should include the following:

시험물질의 약리학적 특성이 면역기능에 영향을 미칠 가능성을 나타내는 경우(예: 항염증 약물), 추가 면역독성시험을 고려하여야 한다. 화합물이 면역계에 영향을 미치는 능력에 관하여 비임상 약리시험에서 얻은 정보는 추가 면역독성시험이 필요한지 결정하기 위한 증거 가중 접근법에 사용할 수 있다.

If the pharmacological properties of a test compound indicate it has the potential to affect immune function (e.g., anti-inflammatory drugs), additional immunotoxicity testing should be considered. Information obtained from the nonclinical pharmacology studies on the ability of the compound to affect the immune system could be used in a weight of evidence approach to decide if additional immunotoxicity studies are needed.

약물의 대상 환자군 대부분이 질병 상태 또는 병용 요법으로 면역저하 상태인 경우 추가 면역독성시험이 필요할 수 있다.

Additional immunotoxicity studies might be warranted if the majority of the patient population for whom the drug is intended is immunocompromised by a disease state or concurrent therapy.

면역억제 특성이 알려진 화합물과 구조적으로 유사한 화합물도 추가 면역독성시험을 고려하여야 한다.

Compounds structurally similar to compounds with known immunosuppressive properties should also be considered for additional immunotoxicity testing.

화합물 및/또는 그 대사체가 면역계 세포에 고농도로 잔류하는 경우 추가 면역독성시험을 고려하여야 한다.

If the compound and/or its metabolites are retained at high concentrations in cells of the immune system, additional immunotoxicity testing should be considered.

약물에 노출된 환자에서 면역독성을 시사하는 임상 소견이 있으면 추가 비임상 면역독성시험이 필요할 수 있다.

Clinical findings suggestive of immunotoxicity in patients exposed to the drug could call for additional nonclinical immunotoxicity testing.

우려할 근거가 있는지 판단하기 위해 위에 제시한 모든 요인의 정보에 대하여 증거 가중 검토를 수행하여야 한다. 한 영역에서 충분한 크기의 소견이 있으면 추가 면역독성시험을 수행하여야 한다. 각각은 단독으로 충분하지 않은 두 가지 이상의 요인에서 나온 소견이 추가 시험을 촉발할 수 있다. 추가 면역독성시험을 수행하지 않는 경우 의뢰자는 그 타당성을 제시하여야 한다.

A weight of evidence review should be performed on information from all the factors outlined above to determine whether a cause for concern exists. A finding of sufficient magnitude in a single area should trigger additional immunotoxicity studies. Findings from two or more factors, each one of which would not be sufficient on its own, could trigger additional studies. If additional immunotoxicity studies are not performed, the sponsor should provide justification.

우려할 근거가 확인되면 화합물의 면역독성 가능성을 확인하기 위해 추가 면역독성시험을 수행하여야 한다. 이러한 시험은 영향을 받는 세포 유형, 가역성 및 작용기전을 확인하는 데에도 도움이 될 수 있다. 이러한 유형의 정보는 잠재적 위해성에 대한 이해를 높이고 임상시험용 바이오마커 선정으로 이어질 수도 있다.

If a cause for concern is identified, additional immunotoxicity studies should be performed to verify the immunotoxic potential of the compound. These studies can also help determine the cell type affected reversibility, and the mechanism of action. This type of information can also provide more insight into potential risk and possibly lead to biomarker selection for clinical studies.

증거 가중 검토 결과 추가 면역독성시험이 필요하다고 판단되면 사용할 수 있는 시험법은 여러 가지가 있다. 표준독성시험 데이터에 면역독성을 시사하는 변화가 있는 경우, 적절하다고 간주되는 추가 면역독성시험의 유형은 관찰된 면역학적 변화의 성격과 해당 화합물 계열이 제기하는 우려에 따라 달라진다. T세포 의존성 항체반응(TDAR)과 같은 면역기능시험을 수행하는 것이 권장된다. STS에서 영향을 받은 특정 세포 유형이 TDAR에 관여하는 것으로 알려져 있지 않은 경우, 영향을 받은 해당 특정 세포 유형의 기능을 측정하는 시험을 수행할 수 있다(부록 참조). 특정 표적이 확인되지 않은 경우에는 TDAR과 같은 면역기능시험이 권장된다.

If the weight-of-evidence review indicates that additional immunotoxicity studies are called for, there are a number of assays which can be used. If there are changes in standard toxicity testing data suggesting immunotoxicity, the type of additional immunotoxicity testing that is considered appropriate will depend on the nature of the immunological changes observed and the concerns raised by the class of compound. It is recommended that an immune function study be conducted, such as a T-cell dependent antibody response (TDAR). If specific cell types that are affected in STS are not known to participate in a TDAR, assays that measure function of that specific affected cell type might be conducted (see the Appendix). Where a specific target is not identified, an immune function study such as the TDAR is recommended.

또한 영향을 받은 특정 세포군을 확인하기 위해 비기능적 시험인 백혈구 집단의 면역표현형 분석을 수행할 수 있으며, 이는 유용한 임상 바이오마커를 제공할 수 있다.

In addition, immunophenotyping of leukocyte populations, a non-functional assay, can be conducted to identify the specific cell populations affected and might provide useful clinical biomarkers.

약물 유발 면역독성을 평가하기 위해 설치류에서 일반적으로 인정되는 시험 설계는 매일 연속 투여하는 28일 시험이다. 비설치류 동물종을 사용하도록 변형한 면역독성 시험법도 보고되어 있다. 추가 면역독성시험에 사용하는 동물종, 계통, 용량, 투여 기간 및 투여 경로는 가능한 경우 유해 면역 영향이 관찰된 표준독성시험과 일치시켜야 한다. 이러한 시험에는 비사람 영장류를 제외하고 대개 암수 모두를 사용하여야 한다. 그 밖의 동물종에서 한쪽 성만 사용하는 경우에는 그 근거를 제시하여야 한다. 고용량은 무독성량(NOAEL)보다 높되 스트레스에 이차적인 변화를 유발하는 수준보다는 낮아야 한다(부록 1.4항 참조). 용량-반응 관계와 면역독성이 관찰되지 않는 용량을 확인하기 위해 여러 용량 수준이 권장된다.

To assess drug-induced immunotoxicity, a generally accepted study design in rodents is a 28 day study with consecutive daily dosing. Adaptations of immunotoxicity assays have been described using non-rodent species. The species, strain, dose, duration, and route of administration used in additional immunotoxicity studies should be consistent, where possible, with the standard toxicity study in which an adverse immune effect was observed. Usually both sexes should be used in these studies, excluding nonhuman primates. Rationale should be given when one sex is used in other species. The high dose should be above the no observed adverse effect level (NOAEL) but below a level inducing changes secondary to stress (see Appendix, section 1.4). Multiple dose levels are recommended in order to determine dose-response relationships and the dose at which no immunotoxicity is observed.

추가 면역독성시험의 결과는 면역독성 위해성을 합리적으로 판단할 수 있는 충분한 데이터가 있는지에 대하여 평가하여야 한다.

Results from additional immunotoxicity studies should be evaluated as to whether sufficient data are available to reasonably determine the risk of immunotoxicity:

증거 가중 검토 결과 추가 면역독성시험이 적절하다고 판단되면, 이 시험은 대규모 환자군이 노출되기 전, 대개 제3상 이전에 완료하여야 한다. 이렇게 하면 적절한 경우 임상시험에 면역계 지표 모니터링을 포함할 수 있다. 추가 면역독성시험의 시기는 시험물질에 의한 영향의 성격과, 추가 면역독성시험에서 양성 소견이 관찰될 경우 필요하게 될 임상시험의 유형에 따라 결정할 수 있다. 대상 환자군이 면역저하 상태인 경우에는 의약품 개발의 보다 이른 시점에 면역독성시험을 시작할 수 있다.

If the weight-of-evidence review indicates that additional immunotoxicity studies are appropriate, these should be completed before exposure of a large population of patients, usually Phase III. This will allow for the incorporation of monitoring immune system parameters in the clinical studies if appropriate. The timing of the additional immunotoxicity testing might be determined by the nature of the effect by the test compound and the type of clinical testing that would be called for if a positive finding is observed with the additional immunotoxicity testing. If the target patient population is immunocompromised, immunotoxicity testing can be initiated at an earlier time point in the development of the drug.

다음 표는 면역독성 징후에 대하여 표준독성시험에서 평가하여야 할 지표를 열거한 것이다. 이들 지표(혈액학 및 임상화학 제외)와 시료 채취 및 조직 절편 평가 방법은 독성병리 전문 학회의 문서에 보다 상세히 기술되어 있다.

The following table lists the parameters that should be evaluated in standard toxicity studies for signs of immunotoxicity. These parameters (excluding hematology and clinical chemistry) and methods for obtaining samples and evaluating tissue sections are described in more detail in documents from professional toxicological pathology societies.

면역독성을 평가하기 위해 총 백혈구 수 및 절대 백혈구 감별 계수가 권장된다. 글로불린 수치의 변화를 평가할 때에는 다른 요인(예: 간독성, 신독성)을 고려하여야 한다. 혈청 글로불린의 변화는 혈청 면역글로불린에 변화가 있다는 지표일 수 있다. 혈청 면역글로불린은 면역억제의 민감하지 않은 지표이지만, 면역글로불린 수치의 변화는 표적 세포군이나 작용기전을 더 잘 이해하기 위해 특정 상황에서 유용할 수 있다.

Total leukocyte counts and absolute differential leukocyte counts are recommended to assess immunotoxicity. When evaluating changes in globulin levels, other factors should be taken into account (e.g., liver toxicity, nephrotoxicity). Changes in serum globulins can be an indication that there are changes in serum immunoglobulins. Although serum immunoglobulins are an insensitive indicator of immunosuppression, changes in immunoglobulins levels can be useful in certain situations in order to better understand target cell populations or mechanism of action.

모든 림프조직은 부검 시 육안적 변화를 평가하여야 한다. 그러나 설치류의 파이어판은 크기가 작아 평가가 더 어려울 수 있다. 비장과 흉선의 무게를 기록하여야 한다. 개와 원숭이에서 비장 무게의 변동을 최소화하기 위해 부검 시 동물을 충분히 방혈하는 것이 권장된다. 노화에 따른 흉선 위축으로 정확한 흉선 무게를 얻지 못할 수 있다.

All lymphoid tissues should be evaluated for gross changes at necropsy. However, this can be more difficult for the Peyer’s patches of rodents due to the small size. Spleen and thymus weights should be recorded. To minimize variability of spleen weights in dogs and monkeys, bleeding the animals thoroughly at necropsy is recommended. Atrophy of the thymus with aging can preclude obtaining accurate thymus weight.

비장과 흉선의 병리조직학적 변화는 전신 면역독성의 지표로 평가하여야 한다. 약물 투여 부위로부터 배액되거나 투여 부위와 접촉하는(따라서 가장 높은 약물 농도에 노출되는) 림프조직을 검사하여야 한다. 이러한 부위에는 경구 투여 약물의 경우 파이어판과 장간막 림프절, 흡입 경로로 투여하는 약물의 경우 기관지 연관 림프조직(BALT), 흡입 또는 비강 경로로 투여하는 약물의 경우(가능하면) 비강 연관 림프조직(NALT), 그리고 경피, 근육내, 피내, 척수강내 또는 피하 경로로 투여하는 약물의 경우 가장 가까운 국소 배액 림프절이 포함된다. 선정하는 특정 림프절과 추가 림프절은 의뢰자의 경험에 근거하여 의뢰자가 재량으로 정한다. 정맥 투여 약물의 경우 비장을 배액 림프조직으로 간주할 수 있다.

Histopathological changes of the spleen and thymus should be evaluated as an indicator of systemic immunotoxicity. The lymphoid tissue that drains or contacts the site of drug administration (and therefore is exposed to the highest concentration of the drug) should be examined. These sites include the Peyer’s patches and mesenteric lymph nodes for orally administered drugs, bronchus-associated lymphoid tissues (BALT) for drugs administered by the inhalation route, nasal-associated lymphoid tissues (NALT) for drugs administered by the inhalation or nasal route (if possible), and the most proximal regional draining lymph nodes for drugs administered by the dermal, intramuscular, intradermal, intrathecal, or subcutaneous routes. The specific node selected and the additional lymph node should be at the discretion of the sponsor based on the sponsor's experience. For intravenously administered drugs, the spleen can be considered the draining lymphoid tissue.

림프조직의 변화를 기록하고 투여 관련 변화를 보고할 때에는 림프조직 구획별 변화에 대한 "반정량적" 기술을 사용하는 것이 권장된다.

It is recommended that a “semi-quantitative” description of changes in compartments of lymphoid tissues be used in recording changes and reporting treatment-related changes in lymphoid tissues.

표준독성시험에서 최대내약용량 근처 또는 그 용량에서는 (예: 과장된 약력학 작용에 의한) 스트레스와 관련된 면역계 변화가 나타날 수 있다. 면역계에 대한 이러한 영향은 코르티코스테론 또는 코르티솔 분비 증가나 그 밖의 매개물질을 통해 매개될 수 있다. 흔히 관찰되는 스트레스 관련 면역 변화로는 순환 호중구 증가, 순환 림프구 감소, 흉선 무게 감소, 흉선 피질 세포충실도 감소 및 이와 관련된 병리조직학적 변화, 비장 및 림프절 세포충실도 변화가 있다. 부신 무게 증가 및/또는 부신피질 과형성의 조직학적 증거도 관찰될 수 있다. 체중 및 신체 활동 감소와 같은 임상 징후가 있을 때의 흉선 무게 감소는 너무 흔히 스트레스 탓으로 돌려진다. 이러한 소견만으로 스트레스 관련 면역독성의 충분한 증거로 보아서는 안 된다.

With standard toxicity studies, doses near or at the maximum tolerated dose can result in changes to the immune system related to stress (e.g., by exaggerated pharmacodynamic action). These effects on the immune system might be mediated by increased corticosterone or cortisol release or other mediators. Commonly observed stress-related immune changes include increases in circulating neutrophils, decreases in circulating lymphocytes, decreases in thymus weight, decreases in thymic cortical cellularity and associated histopathologic changes, and changes in spleen and lymph node cellularity. Increases in adrenal gland weight and/or histologic evidence of adrenal cortical hyperplasia can also be observed. Thymic weight decreases in the presence of clinical signs, such as decreased body weight and physical activity, are too often attributed to stress. These findings on their own should not be considered sufficient evidence of stress-related immunotoxicity.

추가 면역독성시험을 수행하지 않는 것을 정당화하려면 스트레스의 증거가 설득력 있어야 한다.

The evidence of stress should be compelling in order to justify not conducting additional immunotoxicity studies.

일반적으로 선정한 면역독성시험은 널리 사용되고 있어야 하며, 알려진 면역억제제에 대하여 적절한 민감도와 특이성이 입증된 것이어야 한다. 그러나 특정 상황에서는 광범위한 밸리데이션이 완료되지 않았거나 시험법이 널리 사용되지 않을 수 있다. 이러한 경우에는 해당 시험법 사용에 대한 과학적/기전적 근거가 필요하며, 가능하면 적절한 양성대조를 포함하여야 한다.

In general, the immunotoxicity test selected should be widely used and have been demonstrated to be adequately sensitive and specific for known immunosuppressive agents. However, in certain situations, extensive validation might have not been completed and/or the assay might not be widely used. In these situations, a scientific/mechanistic basis for use of the assay is called for and, if feasible, appropriate positive controls should be incorporated.

각 유형의 면역독성시험에서 시험기관에 따라 반응의 차이가 있을 수 있다. 대부분의 경우 이러한 차이는 시험법의 면역독성 평가 능력에 영향을 미치지 않는다. 그러나 적절한 시험법 성능과 시험기관의 숙련도를 보장하기 위해 몇 가지 표준 기술적 밸리데이션 지표를 준수하여야 한다. 이러한 지표에는 시험 내 및 시험 간 정밀성, 시험자 간 정밀성, 정량한계, 정량의 직선 구간 및 시험 시료 안정성의 확인이 포함될 수 있다. 또한 알려진 면역억제제에 대한 시험법의 민감도를 확립하여야 한다. 비사람 영장류 시험을 제외하고, 각 시험기관은 수행 숙련도를 입증하기 위해 시험약과 동시에 또는 주기적으로 양성대조를 시험하는 것이 권장된다. 면역표현형 분석의 경우 기술적으로 적절히 밸리데이션되었다면 시험마다 양성대조를 추가할 필요는 없을 수 있다.

There can be variations of response for each type of immunotoxicity test used by different labs. In most situations, these changes do not affect the ability of the assay to assess immunotoxicity. However, to ensure proper assay performance and lab proficiency, several standard technical validation parameters should be observed. These parameters can include determining intra- and inter-assay precision, technician-to-technician precision, limit of quantitation, linear region of quantitation and test sample stability. In addition, assay sensitivity to known immunosuppressive agents should be established. It is recommended that each laboratory test a positive control concomitantly with an investigational compound or periodically in order to demonstrate proficiency of performance, except for studies with non-human primates. For immunophenotyping, if properly validated technically, the addition of positive controls for each study might not be needed.

면역독성시험은 비임상시험관리기준(GLP)에 따라 수행할 것으로 기대된다. 아래에 기술한 것과 같은 일부 특수 시험법은 GLP를 완전히 준수하지 못할 수 있음을 인정한다.

Immunotoxicity studies are expected to be performed in compliance with Good Laboratory Practice (GLP). It is recognized that some specialized assays, such as those described below, might not comply fully with GLP.

TDAR은 강한 항체반응을 일으키는 공인된 T세포 의존성 항원(예: 양 적혈구(SRBC) 또는 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH))을 사용하여 수행하여야 한다. 선정한 평가변수는 선택한 시험법과 동물종에 가장 적절한 것으로 그 타당성을 제시하여야 한다.

The TDAR should be performed using a recognized T-cell dependent antigen (e.g., sheep red blood cells (SRBC) or keyhole limpet hemocyanin (KLH)) that results in a robust antibody response. The endpoint selected should be justified as the most appropriate for the chosen assay and the selected species.

면역용 항원은 타당한 근거 없이 면역보조제와 함께 사용해서는 안 된다. 알룸(alum)은 비사람 영장류 시험에서만 사용이 허용될 수 있다. 상대적 TDAR 반응은 특히 생쥐에서 계통에 따라 달라질 수 있다. 비근교계 랫드에서는 같은 군 내 랫드 간에 상당한 변동이 있을 수 있다. STS에 사용한 계통과 연결(bridge)할 수 있는 충분한 노출 데이터를 제공하는 경우 근교계 랫드 계통을 사용할 수 있다.

Antigens for immunization should not be used with adjuvants without justification. Alum might be considered acceptable for use only in non-human primate studies. The relative TDAR response can be strain-dependent, especially in mice. With outbred rats, there can be significant variability among rats within the same group. Inbred rat strains could be used with provision of sufficient exposure data to bridge to the strain used in the STS.

항체는 ELISA 또는 그 밖의 면역분석법으로 측정할 수 있다. 항체생성세포 반응과 비교한 이 방법의 장점 중 하나는 시험 기간 중 시료를 연속적으로 채취할 수 있다는 점이다. 원숭이에서는 반응 동태의 개체 간 변동이 크므로 연속 채혈이 중요할 수 있다. 이러한 시험에서는 데이터를 여러 채취일에 걸친 항체반응의 합(예: 곡선하면적)으로 나타낼 수 있다.

Antibody can be measured by using an ELISA or other immunoassay methods. One advantage of this method over the antibody forming cell response is that samples can be collected serially during the study. In monkeys, serial blood collection can be important due to the high inter-animal variability in the kinetics of the response. For these studies, data can be expressed as the sum of the antibody response over several collection dates (e.g., area under the curve).

ELISA에 SRBC 항원을 사용하는 경우 플레이트에 코팅하는 포획 항원의 조제가 중요한 것으로 간주된다. 고정한 전체 적혈구 또는 막 조제물을 SRBC 포획 항원으로 사용할 수 있다. ELISA 결과는 농도 또는 역가로 나타내야 하며, 흡광도로 나타내는 것은 권장되지 않는다.

When SRBC antigens are used for an ELISA, the preparation of the capture antigen that is coated on the plates is considered critical. Whole fixed erythrocytes or membrane preparations can be used as the SRBC capture antigen. ELISA results should be expressed either as concentration or as titer, but expression as optical densities is not recommended.

면역표현형 분석은 항체를 사용하여 백혈구 아집단을 식별 및/또는 계수하는 것이다. 면역표현형 분석은 대개 유세포 분석 또는 면역조직화학으로 수행한다.

Immunophenotyping is the identification and/or enumeration of leukocyte subsets using antibodies. Immunophenotyping is usually conducted by flow cytometric analysis or by immunohistochemistry.

특정 세포군을 계수하는 데 사용하는 유세포 분석은 기능시험이 아니다. 그러나 유세포 분석은 림프구의 항원 특이적 면역반응을 측정하는 데 사용할 수 있다. 말초혈액에서 얻은 데이터는 말초혈액 백혈구도 평가하는 임상시험과의 연결 자료로 유용할 수 있다. 투여 관련 변화를 평가할 때에는 림프구 아집단의 백분율과 함께 절대 수를 사용하는 것이 권장된다.

Flow cytometry, when employed to enumerate specific cell populations, is not a functional assay. However, flow cytometry can be used to measure antigen-specific immune responses of lymphocytes. Data obtained from peripheral blood can be useful as a bridge for clinical studies in which peripheral blood leukocytes are also evaluated. It is recommended that absolute numbers of lymphocyte subsets as well as percentages be used in evaluating treatment-related changes.

유세포 분석과 비교한 면역조직화학의 장점 중 하나는 면역독성 징후가 관찰된 경우 표준독성시험의 조직을 후향적으로 분석할 수 있다는 점이다. 또한 림프조직 내 특정 구획 안의 세포 유형 변화를 관찰할 수 있다. 일부 동물종의 일부 림프구 표지자는 포르말린 고정에 민감하여 특정 고정액으로 고정하거나 급속 동결한 조직에서만 위치를 확인할 수 있다. 면역조직화학으로는 백혈구 정량과 염색 강도 정량이 훨씬 더 어렵다.

One of the advantages of immunohistochemistry over flow cytometry is that tissues from standard toxicity studies can be analyzed retrospectively if signs of immunotoxicity are observed. In addition, changes in cell types within a specific compartment within the lymphoid tissue can be observed. Some of the lymphocyte markers for certain species are sensitive to formalin fixation and can only be localized in tissue that are either fixed with certain fixatives or flash frozen. Quantitation of leukocytes and intensity of staining is much more difficult with immunohistochemistry.

특정 백혈구 집단의 변화를 특성분석하거나 확인하기 위해 면역표현형 분석을 사용하는 경우, 평가할 림프 장기 및/또는 말초혈액은 관찰된 변화에 근거하여 선택하여야 한다. 면역표현형 분석은 표준 반복투여독성시험에 쉽게 추가할 수 있으며, 투여기간과 약물 비노출 기간(회복기간) 동안 변화를 추적할 수 있다.

When immunophenotyping studies are used to characterize or identify alterations in specific leukocyte populations, the choice of the lymphoid organs and/or peripheral blood to be evaluated should be based on changes observed. Immunophenotyping can be easily added to standard repeat dose toxicity studies and changes can be followed during the dosing phase and periods without drug exposure (reversal period).

자연살해(NK)세포 활성 시험은 면역표현형 분석에서 수의 변화가 나타나거나, STS에서 바이러스 감염률 증가가 나타나거나, 그 밖의 요인에 대응하여 수행할 수 있다. 일반적으로 모든 NK세포 시험은 시험물질을 투여한 동물에서 조직(예: 비장) 또는 혈액을 얻는 생체외(ex vivo) 시험이다. 세포 조제물을 ⁵¹Cr로 표지한 표적세포와 함께 배양한다. 비방사성 표지를 사용하는 새로운 방법은 적절히 밸리데이션된 경우 사용할 수 있다. 충분한 수준의 세포독성을 얻고 곡선을 작성하기 위해 시험마다 여러 효과세포 대 표적세포 비율을 평가하여야 한다.

Natural killer (NK) cell activity assays can be conducted if immunophenotyping studies demonstrate a change in number, or if STS studies demonstrate increased viral infection rates, or in response to other factors. In general, all NK cell assays are ex vivo assays in which tissues (e.g., spleen) or blood are obtained from animals that have been treated with the test compound. Cell preparations are co-incubated with target cells that have been labeled with ⁵¹Cr. New methods that involve non-radioactive labels can be used if adequately validated. Different effector to target cell ratios should be evaluated for each assay to obtain a sufficient level of cytotoxicity and generate a curve.

숙주 저항성 시험은 시험물질을 여러 용량으로 투여한 생쥐 또는 랫드 군에 다양한 농도의 병원체(세균, 진균, 바이러스, 기생충) 또는 종양세포를 접종(challenge)하는 것이다. 부형제 투여 동물과 시험물질 투여 동물에서 관찰된 병원체의 감염성 또는 종양 부담을 비교하여 시험물질이 숙주 저항성을 변화시킬 수 있는지 판단한다.

Host resistance studies involve challenging groups of mice or rats treated with the different doses of test compound with varying concentrations of a pathogen (bacteria, fungal, viral, parasitic) or tumor cells. Infectivity of the pathogens or tumor burden observed in vehicle versus test compound treated animals is used to determine if the test compound is able to alter host resistance.

리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes), 폐렴연쇄상구균(Streptococcus pneumoniae), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 인플루엔자 바이러스, 거대세포바이러스, 플라스모디움 요엘리(Plasmodium yoelii) 및 선모충(Trichinella spiralis)과 같은 다양한 병원체를 평가하기 위한 모델이 개발되어 있다. 생쥐의 종양 숙주 저항성 모델에는 B16F10 흑색종 및 PYB6 육종 종양세포주가 사용되었다.

Models have been developed to evaluate a wide range of pathogens such as Listeria monocytogenes, Streptococcus pneumoniae, Candida albicans, influenza virus, cytomegalovirus, Plasmodium yoelii and Trichinella spiralis. Tumor host resistance models in mice have used the B16F10 melanoma and PYB6 sarcoma tumor cell lines.

숙주 저항성 시험은 특정 계열의 감염원 또는 종양세포에 대한 감수성 정보를 제공할 수 있으며 위험관리계획에 영향을 줄 수 있다. 또한 시험물질이 영향을 미치는 세포 유형을 확인하거나 확증하는 데 중요한 역할을 할 수 있다. 더욱이 숙주 저항성 시험에는 특이적 면역기능시험이 개발되지 않은 선천면역 기전이 관여한다. 숙주 저항성 시험을 수행할 때 시험자는 시험물질이 병원체 또는 종양세포의 증식과 병원성에 미치는 직접적 또는 간접적(면역 매개가 아닌) 영향을 신중히 고려하여야 한다. 예를 들어, 특정 종양세포의 증식을 억제하는 화합물은 숙주 저항성을 증가시키는 것처럼 보일 수 있다. 병원체에 대한 직접 영향을 시험하기 위한 시험관내 시험이 권장된다.

Host resistance assays can provide information on the susceptibility to particular classes of infectious agents or tumor cells and can have an impact on the risk management plan. In addition, they can have an important role in identifying or confirming the cell type affected by a test compound. Moreover, host resistance assays involve innate immune mechanisms for which specific immune function assays have not been developed. In conducting host resistance studies, the investigator should carefully consider the direct or indirect (non-immune mediated) effects of the test compound on the growth and pathogenicity of the organism or tumor cell. For instance, compounds that inhibit the proliferation of certain tumor cells can seem to increase host resistance. An in vitro assay to test direct effects on the organism is recommended.

여러 동물종에 대하여 시험관내 대식세포 및 호중구 기능 시험(식세포작용, 산화적 폭발, 화학주성 및 세포용해 활성)이 발표되어 있다. 이러한 시험은 시험관내에서 시험물질에 노출되었거나 시험물질을 투여한 동물에서 얻은(생체외(ex vivo) 시험) 세포의 대식세포/호중구 기능을 평가한다. 시험물질에 대한 시험관내 노출도 조사할 수 있다. 방사성 또는 형광 표지한 표적을 탐식하는 세망내피세포에 대한 영향을 평가하기 위해 생체내 시험도 사용할 수 있다.

In vitro macrophage and neutrophil function assays (phagocytosis, oxidative burst, chemotaxis, and cytolytic activity) have been published for several species. These assays assess macrophage/neutrophil function of cells exposed to the test compound in vitro or obtained from animals treated with the test compound (ex vivo assay). In vitro exposure to test compound can also be investigated. An in vivo assay can also be used to assess the effects on the reticuloendothelial cell to phagocytize radioactively or fluorescently labeled targets.

세포매개면역을 측정하는 시험은 항체반응에 사용되는 시험만큼 잘 확립되어 있지 않다. 이는 감작에 항원을 사용하는 생체내 시험이다. 평가변수는 접종(challenge)에 대한 반응을 약물이 조절하는 능력이다. 단백질 면역 및 접종을 이용한 지연형 과민(DTH) 반응이 생쥐와 랫드에서 보고되었다. 접촉감작물질을 사용하는 모델이 생쥐에서 검토되었으나 충분히 밸리데이션되거나 널리 사용되지는 않았다. 생쥐에서 바이러스, 종양세포주 또는 동종이식편을 항원 접종으로 사용하여 세포독성 T세포 반응을 유도할 수 있다. 원숭이 DTH 반응도 보고되었다. 그러나 원숭이에서의 이러한 반응은 일관되게 재현하기가 매우 어렵다. 또한 DTH 반응을 항체 및 보체 매개 아르투스 반응(Arthus reaction)으로 오인하지 않도록 하여야 한다.

Assays to measure cell-mediated immunity have not been as well established as those used for the antibody response. These are in vivo assays where antigens are used for sensitization. The endpoint is the ability of drugs to modulate the response to challenge. Delayed-type hypersensitivity (DTH) reactions with protein immunization and challenge have been reported for mice and rats. Models in which contact sensitizers are used have been explored in mice but have not been well validated or extensively used. Cytotoxic T cell response can be generated in mice using a virus, tumor cell line, or allograft as the antigenic challenge. Monkey DTH reactions have also been reported. However, these reactions in monkeys are very difficult to consistently reproduce. In addition, one should make sure that the DTH response is not mistaken for an antibody and complement mediated Arthus reaction.