A1 이 문서에서 미량채혈(microsampling)이란 아주 적은 양의 혈액(일반적으로 ≤50 µL)을 채취하는 방법으로, 일반적으로 약물 및/또는 그 대사체의 농도를 측정하고 이어서 적절한 TK 파라미터를 산출하는 데 쓰인다. 미량채혈 기법에 쓰는 적절한 매트릭스로는 혈액과 혈액에서 얻은 혈장 또는 혈청이 있으며, 이들은 운반, 보관 및 이후 분석을 위하여 액체 또는 건조 형태로 사용할 수 있다. TK를 위한 미량채혈은 설치류와 비설치류 모두에 사용할 수 있다. 혈액 유래가 아닌 매트릭스의 미량채혈은 이 Q&A 문서의 적용 범위에 해당하지 않는다.

A1 For the purpose of this document, microsampling is a method to collect a very small amount of blood (typically ≤50 µL) that is generally used to measure concentrations of a drug and/or its metabolites, and subsequently calculate the appropriate TK parameters. The appropriate matrices used for microsampling techniques include blood and its derived plasma or serum, which can be used in liquid or dried form for transportation, storage and subsequent analysis. Microsampling for TKs can be used in rodents and non-rodents. Microsampling in non-blood derived matrices is outside the scope of this Q&As document.

A2 채혈량을 최소화하면 동물의 통증과 고통을 줄이고 설치류와 비설치류의 동물복지를 향상시킬 수 있다(개선). 또한 본시험 동물에서 TK 평가를 수행하는 경우 TK 위성군을 없앨 수 있고, 설치류 시험에 사용하는 경우 TK 위성군에 필요한 동물 수를 줄일 수 있다(감소). 이 이점은 특히 마우스에서 두드러지는데, 기존 시료량을 사용하는 TK 시험에서는 일반적으로 상당수의 마우스가 위성군에 사용되기 때문이다. 미량채혈의 주된 과학적 장점은 안전성 자료와 약물 노출 사이의 관계를 같은 동물에서 직접 평가할 수 있다는 점이다.

A2 Minimizing the volume of blood collection can reduce pain and distress in animals and improve the animal welfare (refinement) of rodents and non-rodents. It can also eliminate the TK satellite group in which the TK assessment is conducted in main study animals or, reduce the number of required animals in a TK satellite group when used in rodent studies (reduction). The benefit is particularly notable for mice, since a significant number of these animals are generally used in satellite groups, in TK studies using conventional sample volumes. The main scientific advantage of microsampling is that the relationship between the safety data and drug exposure can be directly evaluated in the same animal.

A3 일반적으로 미량채혈은 바이오의약품을 포함한 대부분의 의약품에 적용할 수 있다. 그러나 모든 종류의 분석대상물질에 대하여, 확보할 수 있는 적은 시료량으로 측정법의 감도가 적절한지 사례별로 고려하여야 한다.

A3 Generally, microsampling is applicable to the majority of pharmaceuticals including biopharmaceuticals. However, for all types of analytes, consideration should be given on a case-by-case basis as to whether the sensitivity of the measurement method is appropriate with the small sample volumes available.

미량채혈은 단회투여 또는 반복투여 독성시험, 그 밖의 독성시험(예: 발암성시험, 유약동물 시험, 생식시험) 등 어떤 종류의 독성시험에도 사용할 수 있다. 미량채혈을 적용할 때에는 S3A 가이드라인에서 언급한 바와 같이 대표 하위군에서 채혈하는 것도 허용된다. 성숙 동물에서 소량의 혈액을 채취하였을 때 주요 수의 임상병리 또는 병리 파라미터에 영향이 없음을 보여 주는 공개된 사례가 있다. 그러나 약물 농도가 낮아 대부분 또는 모든 시료가 정량한계 미만(Below the Limit of Quantification, BLQ)인 경우(예: 국소 또는 흡입 투여 후의 노출)에는 미량채혈이 적합하지 않다.

Microsampling can be used in any type of toxicology study, such as single-dose or repeat-dose toxicology studies, and other toxicology studies (e.g. carcinogenicity, juvenile and reproductive studies). When microsampling is applied, sampling of a representative subgroup is acceptable, as mentioned in the S3A guideline. There are published examples demonstrating no impact on key veterinary clinical pathology or pathological parameters when small volumes of blood are taken from adult animals. However, microsampling is not warranted when the drug concentration is low and the majority or all samples are Below the Limit of Quantification (BLQ) (e.g., exposure after topical or inhaled administration).

그러나 미량채혈용 생체시료 분석법의 정량하한(Lower Limit Of Quantitation, LLOQ)이 기존 시료량 분석법의 정량하한과 같으면, 대부분 또는 모든 시료가 BLQ이더라도 미량채혈을 사용할 수 있다.

However, when the bioanalytical method for microsampling has the same Lower Limit Of Quantitation (LLOQ) with that for conventional sample volume, microsampling can be used even if majority or all samples are BLQ.

A4 동태 시료 채취의 다른 접근법과 마찬가지로, 미량채혈 기법을 적절히 도입하려면 분석 결과의 신뢰성을 보장하도록 생체시료 분석법을 개발하고 적격성 평가(또는 GLP(Good Laboratory Practice) 시험의 경우 각 지역의 규제 가이드라인/지침에 따라 밸리데이션)를 하여야 한다. 미량채혈 방법을 확립하려면 LLOQ, 정확성, 정밀성, 보관 전 희석에 따른 매트릭스의 영향, 채취·보관·처리 조건의 전 기간에 걸친 생체 매트릭스 내 분석대상물질의 안정성 같은 분석 특성을 신중하게 평가하여야 한다. 일부 시험에서 이미 기존 방법을 사용하였고 다른 시험에 미량채혈을 제안하는 경우, 해당 매트릭스에서 미량채혈과 기존 방법 사이의 노출 측정값 비교성이 필요할 수 있다.

A4 As with other approaches to kinetic sampling, in order to adopt a microsampling technique appropriately, a bioanalytical method should be developed and qualified (or validated for Good Laboratory Practice studies, in accordance with regulatory guideline/guidance in each region) to ensure the reliability of analytical results. Analytical characteristics, such as LLOQ, accuracy, precision, influence of matrix using dilution prior to storage and the stability of the analyte(s) in the biological matrix for the entire period of sampling, storage and processing conditions, should be carefully assessed in order to establish the microsampling method. When conventional methods have been already used in some studies and microsampling is proposed for others, a comparability of the exposure measurement, in the given matrix, between microsampling and conventional methods may be necessary.

이 비교는 TK 시료가 제공되는 조건이 상당히 다른 경우(예: 미량채혈의 건조 시료 대 기존 채혈의 액체 시료) 특히 중요하다. 이 비교성은 적절한 농도 범위를 평가하고 그 결과 얻은 파라미터를 두 방법 사이에서 비교한다는 전제에서, 매트릭스 농도-시간 곡선하면적(AUC) 및/또는 Cmax를 측정하는 별도의 약물동태(PK) 시험으로 확인할 수 있다. 이 PK 시험이 필요하다면, 미량채혈 절차를 포함할 본시험을 수행하기 전에 완료하여야 한다. 비교를 위한 별도의 PK 시험은 사례별로 적절한 과학적 근거가 있으면 생략할 수 있는데, 예를 들어 같은 채혈 부위에서 채취한 혈액, 혈장 또는 혈청을 비슷한 분석 조건으로 시험하는 경우이다.

This comparison is particularly important if the conditions that the TK samples are presented in are substantially different (e.g. dried sample from microsampling vs. liquid sample from conventional sampling). This comparability can be done in a separate pharmacokinetic (PK) study to measure area under the matrix level concentration-time curve (AUC) and/or Cmax, provided that the appropriate range of concentrations is evaluated, and the resulting parameters compared between the two methods. This PK study, if needed, should be completed prior to conducting definitive studies that will include the microsampling procedure. A separate PK study for comparison may be omitted on a case-by-case basis and with appropriate scientific justification, for example, when using similar assay conditions to test blood, plasma or serum drawn from the same sampling site.

이 비교 과정에서 채혈의 변동성을 확인하기 위하여, 소수의 동물에서 몇 개 시점에 미량채혈로 여러 번 채혈하고 이어서 분석대상물질 농도를 측정하는 것을 고려할 수 있다. 이상적으로는 노출 비교를 위하여 TK 시험 전반과 임상시험에서도 같은 매트릭스를 사용하여야 한다. 시험마다 다른 매트릭스를 사용하는 경우, 서로 다른 매트릭스를 사용한 각 측정값에서 전신 노출을 적절히 평가할 수 있도록 혈액학적 파라미터, 혈장 단백 결합률, 약물의 혈액/혈장(또는 혈청) 비 같은 적절한 요인을 고려하여 매트릭스 사이의 약물 농도 관계를 정의하여야 한다.

During this comparison process, multiple blood collections at a few time points by microsampling from a few animals and their subsequent measurement of analyte concentrations can be considered in order to check the variability of sampling. Ideally, the same matrix should be used throughout the TK studies and also in clinical studies for comparison of exposure. When different matrices are used in different studies, the drug concentration relationship among matrices should be defined considering appropriate factors such as haematological parameters, plasma protein binding ratio and blood/plasma (or serum) ratio of the drug, so that systemic exposure can be evaluated appropriately from each measurement using different matrices.

A5 혈액은 모세관 또는 적절한 소형 채취 기구를 사용하여 꼬리정맥, 복재정맥 등에서 채취할 수 있다. 채취한 혈액과 혈액에서 얻은 혈장 또는 혈청은 액체 또는 건조 형태로 약물 농도 측정에 사용할 수 있다. 경우에 따라 액체 시료는 보관, 운송 및 이후 분석 전에 적절한 용매(vehicle) 또는 블랭크 매트릭스로 희석할 수 있다. 건조 시료 방법도 사용할 수 있는데, 이 방법에서는 보통 시료를 셀룰로스 기반 또는 그 밖의 재질에 직접 묻힌 다음 건조한다. 카드/기구 위 시료에서 일정 지름으로 뚫어낸 부분(sub-punch) 또는 시료 전량을 추출하여 분석할 수 있다. 최근 및 현재 진행 중인 미량채혈 방법의 발전으로 정확한 부피의 혈액을 채취할 수 있게 되어, 별도의 부피 측정 없이 시료 전체를 분석에 사용할 수 있음이 입증되었다.

A5 Blood can be collected from the tail vein, saphenous vein, etc., using capillary tubes or any appropriate miniaturized collection devices. The collected blood, and its derived plasma or serum, can be used to measure drug concentrations in either liquid or dried form. In some cases, liquid samples can be diluted with the appropriate vehicles or blank matrices prior to storage, shipment and subsequent analysis. Dried sample methods are also available, wherein the sample is usually applied directly onto cellulose-based or other types of materials and then dried. A fixed diameter sub-punch or the whole quantity of the sample on the card/device can be extracted and analysed. Recent and on-going advancements in microsampling methods have demonstrated the ability to collect precise volumes of blood, such that the entire sample can be used for analysis without additional volumetric measurements.

또한 새로 개발된 기법도 적절한 밸리데이션을 거쳐 고려할 수 있다.

In addition, newly developed techniques could also be considered with adequate validation.

A6 본시험 동물에서 채혈하는 경우, 채혈이 동물의 생리적 상태에 미치는 영향을 고려하는 것이 중요하다. 고려할 주요 요인으로는 1) 일정 기간에 채취하는 시료의 양과 개수, 2) 시험약의 특성(예: 적혈구에 대한 영향, 항응고 작용 또는 혈역학적 특성), 3) 시험계(예: 동물종, 나이, 체중, 총 혈액량), 4) 채혈 부위가 있다. 잦은 반복 채혈은 혈액학적 파라미터 같은 생리적 자료에 영향을 줄 수 있으므로, 미량채혈의 경우에도 채혈 계획을 적절히 수립하여야 한다. 체중 변화, 사료 섭취량, 혈액학적 파라미터(예: 적혈구 수, 헤모글로빈 수치, 헤마토크릿 값, 평균 적혈구 용적, 전해질, 총단백) 및 채혈 부위에 대한 모든 영향(예: 조직 손상, 염증) 같은 관련 동물 자료를 기록해 두는 것이 신중한 방법이다.

A6 When blood sampling is performed on the main study animals, it is important to consider the effect of blood collection on the physiological condition of the animals. The main factors to consider include; 1) the volume and the number of samples taken in a given period; 2) the properties of the test drug (e.g. its effects on red blood cells, anticoagulant effect, or haemodynamic properties); 3) the test system (e.g. species, age, body weight, total blood volume); and 4) the site of collection. As frequent and repeated blood collection may affect physiological data, such as haematological parameters, sampling protocols should be appropriately established even with microsampling. It is prudent to record the relevant animal data, such as changes in body weight, food consumption, haematological parameters (e.g. red blood cell count, haemoglobin level, haematocrit value, mean corpuscular volume, electrolytes, total proteins), and any effect on the blood collection site (e.g. tissue damage, inflammation).

특정 시험 조건의 맥락에서 의심되는 영향이 시험약과 관련된 것인지 절차와 관련된 것인지를 판단하려면, 시험약 투여군과 같은 횟수·같은 양으로 채혈한 대응 대조 동물과 비교하여 이 파라미터들을 평가하는 것이 중요하다. 이전 시험에서 시험약에 따른 혈액학적 파라미터 변화가 잦은 채혈로 악화될 수 있음이 나타났거나 시험약의 약리 작용이 그러한 영향을 유발할 수 있다고 의심되는 경우, 미량채혈 기법을 사용하더라도 TK 평가에 위성군 동물을 사용하는 것이 타당하다. 또는 과학적 근거가 있으면 희소 채혈(sparse sampling)*을 미량채혈과 함께 사용할 수 있다.

Evaluation of these parameters compared to matching control animals, which have had the same number and volume of samples drawn as the test drug groups, will be important to establish whether any suspected effects are related to test drug or to procedures, within the context of the specific study conditions. If previous studies show that test drug-related changes to haematological parameters could be exacerbated by frequent blood sampling, or it is suspected that the pharmacological action of the test drug may induce such effects, the use of satellite groups of animals for TK assessment would be warranted, even if microsampling techniques are used. Alternatively, sparse sampling* can be used in conjunction with microsampling, if scientifically justified.

A7 각 규제 지역의 생체시료 분석 가이드라인/지침에 규정된 분석법 밸리데이션에 더하여, 미량채혈에서 얻은 시료를 분석할 때에는 다음 사항을 고려하여야 한다.

A7 In addition to the analytical method validation stipulated in the bioanalytical guideline/guidance in each regulatory region, the following points should be considered when analysing samples derived from microsampling:

액체 채혈의 경우 다음 사항을 고려하여야 한다. 1) 예를 들어 피펫팅으로 시료 균질성 확보, 2) 소량 취급 문제(예: 해당하는 경우 보관 중 및 이후 동결/해동 과정에서 생길 수 있는 동결/건조 영향), 3) 제한된 시료량으로 인한 LLOQ 상승 가능성, 4) 작은 용기/모세관에 항응고제를 넣어 시료가 희석되는 영향, 5) 채취 용기에 대한 분석대상물질의 흡착 증가 가능성(즉, 부피 대비 표면적 증가), 6) 시료의 적절한 보존 조건 유지, 7) 일부 방법에서의 오염 위험과 반복 채혈의 어려움.

For liquid sampling, the following issues should be considered 1) ensuring sample homogeneity, for example by pipetting; 2) small volume handling issues (e.g. potential freezing/drying effects during the storage and subsequent freeze/thaw process, as applicable); 3) potential increase in the LLOQ due to the limited sample volume; 4) impact of addition of anticoagulants to small containers/capillaries, resulting in dilution of the sample; 5) potential for increased adsorption of the analyte to the collection container (i.e. increased surface area to volume ratio); 6) keeping the appropriate preservation conditions of the sample; 7) risk of contamination and difficulty of repeated sampling using some methods.

건조 채혈 기법(예: 셀룰로스 또는 비셀룰로스 카드, 고분자 매트릭스 등에 점적)의 경우, 회수율이 적절하고 재현성이 있으며 약물 검출에 대한 매트릭스 간섭이 최소인 방법을 선택하는 것이 중요하다. 건조 점적의 일부를 뚫어내는(sub-punch) 방식을 사용하는 경우, 특히 저분자 약물에서는 분석대상물질 검출이 헤마토크릿 값의 차이에 영향을 받지 않도록 하는 것이 중요하다. 헤마토크릿이 분석대상물질 검출에 미치는 영향은 헤마토크릿 값이 서로 다른 혈액에 알려진 농도의 시험약을 첨가(spiking)하여 측정할 수 있다. 한 점적에서 뚫어낸 여러 시료의 분석대상물질 농도를 평가하거나, 예를 들어 방사성 표지를 사용한 평가로 점적의 균일성을 확인하는 것도 중요하다.

For dried sampling techniques (e.g. spotting onto cellulosic or non-cellulosic card, polymer matrix, etc.), it is important to select the method with adequate and reproducible recovery and minimal matrix interference with detection of the drugs. If the sub-punch of the dried spot approach is used, it is important to ensure that detection of the analyte is not affected by different haematocrit values, especially for small molecule drugs. The effect of haematocrit on analyte detection can be measured by using blood with different haematocrit values and spiking with test drugs of known concentrations. It is also important to confirm the uniformity of the spots by evaluating analyte levels from multiple samples punched out from one spot or, by evaluation, for example, using radiolabels.

정확한 부피의 혈액을 기구에 채취하고 이후 시료 전체를 분석하면 이 두 문제를 모두 최소화할 수 있다.

Both of these issues can be minimized if an accurate volume of blood is collected on the device and the entire sample is subsequently analysed.

투여 후 시료 재분석(Incurred sample reanalysis, ISR)은 각 지역의 지침/가이드라인에 규정이 있으면 그에 따라 수행하여야 한다. ISR을 수행할 때에는 ISR을 위한 충분한 시료량 또는 반복 시료 수(예: 점적, 용기 또는 팁)가 보관되도록 주의하여야 한다.

Incurred sample reanalysis (ISR) should be conducted according to each regional guidance/guideline, if described. When doing ISR, care should be taken to ensure sufficient sample volumes or numbers of replicates (e.g. spots, containers, or tips) are retained for ISR.