이 가이드라인은 ICH S2A 및 S2B 가이드라인을 대체하고 통합한다. 이번 개정의 목적은 사람에 대한 잠재적 위험을 예측하기 위한 표준 유전독성시험 조합을 최적화하고, 결과 해석에 관한 지침을 제공하여, 궁극적으로 유전물질의 변화에 기반한 발암 영향의 위험 특성분석을 개선하는 것이다. 개정된 가이드라인은 표준 유전독성시험 조합에서 나온 시험관내 및 생체내 양성 결과의 후속 시험과 해석에 관하여, 관련성 없는 결과의 평가를 포함하여, 국제적으로 합의된 기준을 기술한다. 이 가이드라인은 사람용 의약품으로 개발 중인 제품에만 적용한다.

This guidance replaces and combines the ICH S2A and S2B Guidelines. The purpose of the revision is to optimize the standard genetic toxicology battery for prediction of potential human risks, and to provide guidance on interpretation of results, with the ultimate goal of improving risk characterization for carcinogenic effects that have their basis in changes in the genetic material. The revised guidance describes internationally agreed upon standards for follow-up testing and interpretation of positive results in vitro and in vivo in the standard genetic toxicology battery, including assessment of non-relevant findings. This guidance is intended to apply only to products being developed as human pharmaceuticals.

최신 경제협력개발기구(Organization for Economic Co-operation and Development, OECD) 가이드라인의 권고사항과 국제 유전독성시험 워크숍(International Workshops on Genotoxicity Testing, IWGT)의 보고서를 관련되는 범위에서 고려하였다. 일부 경우에는 OECD 또는 IWGT 권고사항과 차이가 있으며, 이는 본문에 기재하였다. 다음 지침은 다른 ICH 가이드라인과 함께 적용하여야 한다.

The recommendations from the latest Organization for Economic Co-operation and Development (OECD) guidelines and the reports from the International Workshops on Genotoxicity Testing (IWGT) have been considered where relevant. In certain cases, there are differences from the OECD or IWGT recommendations, which are noted in the text. The following notes for guidance should be applied in conjunction with other ICH guidances.

이 가이드라인은 새로운 "저분자" 원료의약품의 시험에 중점을 두며, 생물의약품에는 적용하지 않는다. 임상 개발 단계에 따른 시험 시기에 관한 권고는 ICH M3(R2) 가이드라인에 제시되어 있다.

The focus of this guidance is testing of new “small molecule” drug substances, and the guidance does not apply to biologics. Advice on the timing of the studies relative to clinical development is provided in the ICH M3 (R2) guidance.

유전독성시험은 다양한 기전으로 유전적 손상을 유발하는 화합물을 검출하도록 설계된 시험관내 및 생체내 시험으로 정의할 수 있다. 이러한 시험은 DNA 손상과 그 고정에 관한 위해요소 확인을 가능하게 한다. 유전자 돌연변이, 대규모 염색체 손상 또는 재조합의 형태로 DNA 손상이 고정되는 것은 일반적으로 유전성 영향에 필수적이며, 유전적 변화가 일부 역할만 할 수도 있는 복잡한 과정인 악성종양의 다단계 과정에서도 필수적인 것으로 간주된다. 염색체 수적 변화 또한 종양 발생과 관련이 있으며, 생식세포에서 이수성(aneuploidy)의 가능성을 나타낼 수 있다. 이러한 종류의 손상을 검출하는 시험에서 양성인 화합물은 사람 발암물질 및/또는 돌연변이원이 될 가능성이 있다.

Genotoxicity tests can be defined as in vitro and in vivo tests designed to detect compounds that induce genetic damage by various mechanisms. These tests enable hazard identification with respect to damage to DNA and its fixation. Fixation of damage to DNA in the form of gene mutations, larger scale chromosomal damage or recombination is generally considered to be essential for heritable effects and in the multi-step process of malignancy, a complex process in which genetic changes might possibly play only a part. Numerical chromosome changes have also been associated with tumorigenesis and can indicate a potential for aneuploidy in germ cells. Compounds that are positive in tests that detect such kinds of damage have the potential to be human carcinogens and/or mutagens.

사람에서 특정 화학물질 노출과 발암 사이의 관계는 확립되어 있는 반면 유전성 질환에 대해서는 유사한 관계를 입증하기 어려웠기 때문에, 유전독성시험은 주로 발암성 예측에 사용되어 왔다. 그럼에도 생식계열 돌연변이는 사람 질환과 분명히 관련되어 있으므로, 화합물이 유전성 영향을 유발할 수 있다는 의심은 화합물이 암을 유발할 수 있다는 의심과 마찬가지로 심각한 것으로 간주된다. 또한 유전독성시험 결과는 발암성 시험의 해석에 유용할 수 있다.

Because the relationship between exposure to particular chemicals and carcinogenesis is established for humans, whilst a similar relationship has been difficult to prove for heritable diseases, genotoxicity tests have been used mainly for the prediction of carcinogenicity. Nevertheless, because germ line mutations are clearly associated with human disease, the suspicion that a compound might induce heritable effects is considered to be just as serious as the suspicion that a compound might induce cancer. In addition, the outcome of genotoxicity tests can be valuable for the interpretation of carcinogenicity studies.

의약품의 등록에는 유전독성 가능성에 대한 포괄적인 평가가 요구된다. 광범위한 검토 결과, 세균을 이용한 복귀돌연변이시험(에임스 시험)에서 돌연변이원성을 보이는 많은 화합물이 설치류 발암물질인 것으로 나타났다. 시험관내 포유류 시험을 추가하면 설치류 발암물질 검출의 민감도가 높아지고 검출되는 유전적 사건의 범위가 넓어지지만, 예측의 특이도는 낮아진다. 즉, 설치류 발암성과 상관관계가 없는 양성 결과의 발생률이 증가한다. 그럼에도 단일 시험으로는 종양 발생과 관련된 모든 유전독성 기전을 검출할 수 없으므로 시험조합 접근방식은 여전히 타당하다.

Registration of pharmaceuticals requires a comprehensive assessment of their genotoxic potential. Extensive reviews have shown that many compounds that are mutagenic in the bacterial reverse mutation (Ames) test are rodent carcinogens. Addition of in vitro mammalian tests increases sensitivity for detection of rodent carcinogens and broadens the spectrum of genetic events detected, but also decreases the specificity of prediction; i.e., increases the incidence of positive results that do not correlate with rodent carcinogenicity. Nevertheless, a battery approach is still reasonable because no single test is capable of detecting all genotoxic mechanisms relevant in tumorigenesis.

표준 시험조합의 일반적 특징은 다음과 같다.

The general features of a standard test battery are as follows:

여러 시험관내 포유류 세포 시스템이 널리 사용되며 충분히 검증된 것으로 볼 수 있다. 즉, 시험관내 중기 염색체 이상시험, 시험관내 소핵시험(주석 1) 및 마우스 림프종 L5178Y 세포 Tk(thymidine kinase) 유전자 돌연변이시험(MLA)이다. 이 세 시험은 이 가이드라인에서 권장하는 시험 프로토콜을 사용하고 의약품 시험을 위한 표준 시험조합에서 다른 유전독성시험과 함께 사용하는 경우, 현재 염색체 손상 측정에 동등하게 적절하며 따라서 서로 대체할 수 있는 것으로 간주된다.

Several in vitro mammalian cell systems are widely used and can be considered sufficiently validated: The in vitro metaphase chromosome aberration assay, the in vitro micronucleus assay (Note 1) and the mouse lymphoma L5178Y cell Tk (thymidine kinase) gene mutation assay (MLA). These three assays are currently considered equally appropriate and therefore interchangeable for measurement of chromosomal damage when used together with other genotoxicity tests in a standard battery for testing of pharmaceuticals, if the test protocols recommended in this Guideline are used.

일부 물질은 시험관내가 아닌 생체내에서만 돌연변이원성을 나타내고(주석 2), 흡수, 분포, 대사 및 배설과 같은 요인을 반영하는 시험을 포함하는 것이 바람직하므로 시험조합에 생체내 시험을 포함한다. 이러한 이유로 현재 적혈구(혈액 또는 골수)의 소핵 분석 또는 골수 중기 세포의 염색체 이상 분석 중 하나를 선택하도록 포함하고 있다(주석 3). 투여 동물에서 배양한 림프구도 세포유전학적 분석에 사용할 수 있으나, 이러한 분석의 경험은 덜 보편적이다.

In vivo test(s) are included in the test battery because some agents are mutagenic in vivo but not in vitro (Note 2) and because it is desirable to include assays that account for such factors as absorption, distribution, metabolism and excretion. The choice of an analysis either of micronuclei in erythrocytes (in blood or bone marrow), or of chromosome aberrations in metaphase cells in bone marrow, is currently included for this reason (Note 3). Lymphocytes cultured from treated animals can also be used for cytogenetic analysis, although experience with such analyses is less widespread.

중기 세포의 염색체 이상을 측정하는 시험관내 및 생체내 시험은 염색체 온전성의 광범위한 변화를 검출할 수 있다. 염색분체 또는 염색체가 절단되어 무동원체 단편이 생기면 소핵이 형성될 수 있다. 따라서 염색체 이상 또는 소핵을 검출하는 시험은 염색체 절단물질(clastogen) 검출에 적절한 것으로 간주된다. 소핵은 후기에 하나 이상의 전체 염색체가 지연(lagging)되어 생길 수도 있으므로, 소핵시험은 일부 이수성 유발물질을 검출할 가능성이 있다. MLA는 유전자 돌연변이와 염색체 손상 모두에서 기인하는 Tk 유전자의 돌연변이를 검출한다. MLA가 염색체 소실도 검출할 수 있다는 일부 근거가 있다.

In vitro and in vivo tests that measure chromosomal aberrations in metaphase cells can detect a wide spectrum of changes in chromosomal integrity. Breakage of chromatids or chromosomes can result in micronucleus formation if an acentric fragment is produced; therefore assays that detect either chromosomal aberrations or micronuclei are considered appropriate for detecting clastogens. Micronuclei can also result from lagging of one or more whole chromosome(s) at anaphase and thus micronucleus tests have the potential to detect some aneuploidy inducers. The MLA detects mutations in the Tk gene that result from both gene mutations and chromosome damage. There is some evidence that MLA can also detect chromosome loss.

시험조합에 사용하거나, 시험관내 또는 생체내 시험 결과를 평가할 때 증거 가중(weight of evidence)을 구축하기 위한 후속 시험으로 사용할 수 있는 몇 가지 추가 생체내 시험이 있다(아래 참조). 측정한 평가변수에 대한 적절한 타당성과 노출 입증(4.4항 참조)을 갖춘 적절한 생체내 시험(보통 2개)에서의 음성 결과는 일반적으로 유의한 유전독성 위험이 없음을 입증하기에 충분한 것으로 간주된다.

There are several additional in vivo assays that can be used in the battery or as follow-up tests to develop weight of evidence in assessing results of in vitro or in vivo assays (see below). Negative results in appropriate in vivo assays (usually two), with adequate justification for the endpoints measured, and demonstration of exposure (see Section 4.4) are generally considered sufficient to demonstrate absence of significant genotoxic risk.

표준 시험조합에 대한 다음 두 옵션은 동등하게 적합한 것으로 간주된다(주석 4).

The following two options for the standard battery are considered equally suitable (Note 4):

옵션 1은 부분적으로 S2A 및 B에 기반하고 있어 과거 경험이 더 많다. 그럼에도 옵션 1과 2를 동등하게 수용 가능한 것으로 보는 근거는 다음과 같다. 시험관내 포유류 세포 시험에서 양성 결과가 나왔을 때, 적절한 조직에서 적절한 노출이 입증된 상태로 잘 수행된 두 생체내 시험의 명확한 음성 결과는 생체내 유전독성 가능성이 없다는 충분한 증거로 간주된다(아래 5.4.1.1항 참조). 따라서 두 생체내 시험을 수행하는 시험 전략은 시험관내 양성 결과를 후속 조사할 때 사용하는 전략과 같다(주석 4).

There is more historical experience with Option 1, partly because it is based on S2A and B. Nevertheless, the reasoning behind considering Options 1 and 2 equally acceptable is as follows: When a positive result occurs in an in vitro mammalian cell assay, clearly negative results in two well conducted in vivo assays, in appropriate tissues and with demonstrated adequate exposure, are considered sufficient evidence for lack of genotoxic potential in vivo (see Section 5.4.1.1 below). Thus a test strategy in which two in vivo assays are conducted is the same strategy that would be used to follow up a positive result in vitro (Note 4).

두 표준 시험조합 옵션 모두에서 생체내 단회 투여 또는 반복 투여 시험 설계를 사용할 수 있다. 반복 투여의 경우, 과학적으로 타당하면 유전독성 평가변수를 독성시험에 통합하도록 시도하여야 한다. 생체내에서 둘 이상의 평가변수를 평가하는 경우 이를 단일 시험에 통합하는 것이 바람직하다. 반복투여 독성시험 용량의 적합성 여부에 관한 충분한 정보가 시험 시작 전에 확보되는 경우가 많으며, 이를 이용하여 단회 투여 시험 또는 통합 시험 중 어느 것이 적합할지 결정할 수 있다.

Under both standard battery options, either acute or repeat dose study designs in vivo can be used. In case of repeated administrations, attempts should be made to incorporate the genotoxicity endpoints into toxicity studies, if scientifically justified. When more than one endpoint is evaluated in vivo it is preferable that they are incorporated into a single study. Often sufficient information on the likely suitability of the doses for the repeat-dose toxicology study is available before the study begins and can be used to determine whether an acute or an integrated test will be suitable.

음성 결과를 나타내는 화합물의 경우, 현행 권고사항에 따라 수행·평가한 표준 시험조합의 어느 한 옵션을 완료하면 보통 유전독성 활성이 없다는 충분한 보증이 되며 추가 시험은 필요하지 않다. 표준 시험조합에서 양성 결과를 나타내는 화합물은 치료적 용도에 따라 보다 광범위하게 시험해야 할 수 있다(5항 참조).

For compounds that give negative results, the completion of either option of the standard test battery, performed and evaluated in accordance with current recommendations, will usually provide sufficient assurance of the absence of genotoxic activity and no additional tests are warranted. Compounds that give positive results in the standard test battery might, depending on their therapeutic use, need to be tested more extensively (see Section 5).

옵션 2에서 생체내 평가의 두 번째 부분으로 사용할 수 있는 생체내 시험이 몇 가지 있으며(4.2항 참조), 그중 일부는 반복투여 독성시험에 통합할 수 있다. 노출과 대사 능력 때문에 간이 일반적으로 선호되는 조직이지만, 생체내 조직과 시험의 선택은 잠재적 기전, 생체내 대사 또는 관련 있다고 생각되는 노출 조직에 관한 지식과 같은 요인에 근거하여야 한다.

There are several in vivo assays that can be used as the second part of the in vivo assessment under Option 2 (see Section 4.2), some of which can be integrated into repeat-dose toxicology studies. The liver is typically the preferred tissue because of exposure and metabolizing capacity, but choice of in vivo tissue and assay should be based on factors such as any knowledge of the potential mechanism, of the metabolism in vivo, or of the exposed tissues thought to be relevant.

수적 변화에 관한 정보는 시험관내 포유류 세포 시험과 시험관내 또는 생체내 소핵시험에서 얻을 수 있다. 표준 프로토콜에서 이러한 가능성을 나타낼 수 있는 요소는 유사분열지수 상승, 배수체 유발 및 소핵 평가이다. 방추체 독(spindle poison)을 MLA에서 검출할 수 있다는 실험적 근거도 있다. 옵션 2에서 선호되는 생체내 세포유전학적 시험은 염색체 소실(이수성 가능성)을 보다 직접적으로 검출할 수 있도록 염색체 이상시험이 아닌 소핵시험이다.

Information on numerical changes can be derived from the mammalian cell assays in vitro and from the micronucleus assays in vitro or in vivo. Elements of the standard protocols that can indicate such potential are elevations in the mitotic index, polyploidy induction and micronucleus evaluation. There is also experimental evidence that spindle poisons can be detected in MLA. The preferred in vivo cytogenetic test under Option 2 is the micronucleus assay, not a chromosome aberration assay, to include more direct capability for detection of chromosome loss (potential for aneuploidy).

제시된 표준 시험 세트가 다른 유전독성시험이 일반적으로 불충분하거나 부적절하다는 것을 의미하지는 않는다. 표준 시험조합에서 얻은 유전독성시험 결과를 추가로 조사하기 위해 추가 시험을 사용할 수 있다(4.2항 및 5항 참조). 필요하고 충분히 검증된 경우 비설치류를 포함한 다른 동물종도 사용할 수 있다.

The suggested standard set of tests does not imply that other genotoxicity tests are generally considered inadequate or inappropriate. Additional tests can be used for further investigation of genotoxicity test results obtained in the standard battery (see Sections 4.2 and 5). Alternative species, including non-rodents, can also be used if indicated, and if sufficiently validated.

기술적 이유로 표준 시험조합의 하나 이상의 시험을 적용할 수 없는 경우, 충분한 과학적 타당성이 제시되면 검증된 대체 시험으로 대신할 수 있다.

Under conditions in which one or more tests in the standard battery cannot be employed for technical reasons, alternative validated tests can serve as substitutes provided sufficient scientific justification is given.

다음 항에서는 표준 시험조합의 변경이 바람직할 수 있는 상황을 기술한다.

The following sections describe situations where modification of the standard test battery might be advisable.

일부 탐색적 임상시험의 경우, 더 적은 수의 유전독성시험 또는 생체내 최대 용량의 타당성에 관한 다른 기준이 적용될 수 있다(ICH M3(R2) 가이드라인 참조).

For certain exploratory clinical studies, fewer genotoxicity assays or different criteria for justification of the maximum dose in vivo might apply (see ICH M3(R2) guidance).

화합물이 세균에 매우 독성인 경우(예: 일부 항생물질)에도, 세포독성 화합물을 포유류 세포에서 시험하는 것과 마찬가지로 세균을 이용한 복귀돌연변이시험(에임스 시험)은 수행하여야 한다. 이는 독성이 덜한 낮은 농도에서 돌연변이원성이 나타날 수 있기 때문이다. 이러한 경우 시험관내 포유류 세포 시험 중 어느 하나도 수행하여야 한다. 즉, 옵션 1을 따라야 한다.

In cases where compounds are highly toxic to bacteria (e.g., some antibiotics), the bacterial reverse mutation (Ames) test should still be carried out, just as cytotoxic compounds are tested in mammalian cells, because mutagenicity can occur at lower, less toxic concentrations. In such cases, any one of the in vitro mammalian cell assays should also be done, i.e., Option 1 should be followed.

대부분의 "구조 경고(structural alert)"가 세균 돌연변이원성과 관련하여 정의되어 있으므로, 구조 경고 화합물(주석 5)은 보통 표준 시험조합에서 검출할 수 있다. 일부 화학물질 계열은 세균 돌연변이시험보다 포유류 세포 염색체 손상 시험에서 더 쉽게 검출되는 것으로 알려져 있다. 따라서 구조 경고를 가진 화합물이 어느 시험조합에서든 음성 결과를 나타내면 보통 유전독성이 없다는 충분한 보증으로 간주된다. 그러나 특정 구조 경고를 가진 화합물의 경우 표준 프로토콜의 변경이 적절할 수 있다(주석 5). 추가 시험 또는 프로토콜 변경의 선택은 해당 구조 경고 화합물의 화학적 특성, 알려진 반응성 및 대사 자료에 따라 달라진다.

Structurally alerting compounds (Note 5) are usually detectable in the standard test battery since the majority of “structural alerts” are defined in relation to bacterial mutagenicity. A few chemical classes are known to be more easily detected in mammalian cell chromosome damage assays than bacterial mutation assays. Thus negative results in either test battery with a compound that has a structural alert is usually considered sufficient assurance of a lack of genotoxicity. However, for compounds bearing certain specific structural alerts, modification to standard protocols can be appropriate (Note 5). The choice of additional test(s) or protocol modification(s) depends on the chemical nature, the known reactivity and any metabolism data on the structurally alerting compound in question.

많은 생체내 시험(일반적으로 골수, 혈액 또는 간)이 유용한 추가 정보를 제공하지 못하는 화합물이 있다. 여기에는 독성동태 또는 약동학 자료상 전신으로 흡수되지 않아 표적 조직에 도달하지 않는 것으로 나타난 화합물이 포함된다. 이러한 화합물의 예로는 일부 방사성 영상제, 알루미늄 기반 제산제, 일부 흡입 투여 화합물, 일부 피부 또는 기타 국소 적용 의약품이 있다. 투여 경로를 변경해도 표적 조직 노출이 충분하지 않고, 가장 많이 노출되는 조직에서 적합한 유전독성시험을 사용할 수 없는 경우에는 시험관내 시험만으로 평가하는 것이 적절할 수 있다. 일부 경우에는 접촉 부위에서의 유전독성 영향 평가가 필요할 수 있으나, 이러한 시험은 아직 널리 사용되지 않았다(주석 6).

There are compounds for which many in vivo tests (typically in bone marrow, blood or liver) do not provide additional useful information. These include compounds for which data on toxicokinetics or pharmacokinetics indicate that they are not systemically absorbed and therefore are not available to the target tissues. Examples of such compounds are some radioimaging agents, aluminum based antacids, some compounds given by inhalation, and some dermally or other topically applied pharmaceuticals. In cases where a modification of the route of administration does not provide sufficient target tissue exposure, and no suitable genotoxicity assay is available in the most exposed tissue, it might be appropriate to base the evaluation only on in vitro testing. In some cases evaluation of genotoxic effects at the site of contact can be warranted, although such assays have not yet been widely used (Note 6).

비교 연구 결과, 정성적인 의미에서 대부분의 생식세포 돌연변이원은 체세포 시험에서 유전독성으로 검출될 가능성이 높으므로, 생체내 체세포 유전독성시험의 음성 결과는 일반적으로 생식세포 영향이 없음을 나타낸다.

Results of comparative studies have shown that, in a qualitative sense, most germ cell mutagens are likely to be detected as genotoxic in somatic cell tests so that negative results of in vivo somatic cell genotoxicity tests generally indicate the absence of germ cell effects.

실험 결과의 재현성은 새로운 방법이나 예상치 못한 결과를 다루는 연구의 필수 요소이다. 그러나 표준적이고 널리 사용되는 유전독성시험으로 의약품을 일상적으로 시험할 때에는 반복이 필요하지 않은 경우가 많다. 이러한 시험은 충분히 특성분석되어 있고 내부 대조가 충분하므로, 명확한 양성 또는 음성 시험을 반복할 필요는 보통 없다. 이상적으로는 시험 결과를 명확한 음성 또는 명확한 양성으로 판정할 수 있어야 한다. 그러나 시험 결과가 양성 또는 음성 판정을 위해 미리 정한 기준에 맞지 않아 "불명확(equivocal)"으로 판정되는 경우가 있다. 통계적 방법의 적용은 자료 해석에 도움이 될 수 있으나, 적절한 생물학적 해석이 매우 중요하다.

Reproducibility of experimental results is an essential component of research involving novel methods or unexpected findings; however, the routine testing of drugs with standard, widely used genotoxicity tests often does not call for replication. These tests are sufficiently well characterized and have sufficient internal controls that repetition of a clearly positive or negative assay is not usually warranted. Ideally it should be possible to declare test results clearly negative or clearly positive. However, test results sometimes do not fit the predetermined criteria for a positive or negative call and therefore are declared “equivocal”. The application of statistical methods can aid in data interpretation; however, adequate biological interpretation is of critical importance.

불명확한 시험을 반복하면 (i) 명확한 양성 결과가 나와 전체적으로 양성 결과가 되거나, (ii) 음성 결과가 나와 결과가 재현되지 않아 전체적으로 음성이 되거나, (iii) 다시 불명확한 결과가 나와 최종 결론이 불명확으로 남을 수 있다.

An equivocal test that is repeated might result in (i) a clearly positive outcome, and thus an overall positive result; (ii) a negative outcome, so that the result is not reproducible and overall negative, or (iii) another equivocal result, with a final conclusion that remains equivocal.

프로토콜에 관한 권고는 OECD 가이드라인(1997)과 IWGT 보고서(Gatehouse et al., 1994)에 제시되어 있다.

Advice on the protocols is given in the OECD guideline (1997) and the IWGT report (Gatehouse et al., 1994).

용해도나 세포독성에 의해 제한되지 않는 경우 권장 최대 용량 수준은 5000 µg/plate(액상 시험물질은 5 µL/plate)이다.

The maximum dose level recommended is 5000 µg/plate (or 5 µL/plate for liquid test substance) when not limited by solubility or cytotoxicity.

세균 배양의 경우, 침전물이 계수를 방해하지 않고, 독성이 제한 요인이 아니며, 최고 농도가 5000 µg/plate(액상 시험물질은 5 µL/plate)를 초과하지 않으면 침전이 생기는 용량도 계수한다. 세포독성이 관찰되지 않으면 침전이 생기는 가장 낮은 용량을 계수 대상 최고 용량으로 사용하여야 한다. 용해도와 관계없이 용량 의존적인 세포독성 또는 돌연변이원성이 관찰되면, 계수 대상 최고 용량은 아래에 기술한 바와 같이 세포독성에 근거하여야 한다.

For bacterial cultures, precipitating doses are scored provided precipitate does not interfere with scoring, toxicity is not limiting, and the top concentration does not exceed 5000 µg/plate (or 5 µL/plate for liquid test substance). If no cytotoxicity is observed, then the lowest precipitating dose should be used as the top dose scored. If dose related cytotoxicity or mutagenicity is noted, irrespective of solubility, the top dose scored should be based on cytotoxicity as described below.

에임스 시험에서 계수하는 용량은 유의한 독성의 증거를 보여야 하나, 최고 용량 5000 µg/plate를 초과해서는 안 된다. 독성은 복귀돌연변이체 수의 감소 및/또는 배경 균층(background lawn)의 소실 또는 감소로 검출될 수 있다.

In the Ames test, the doses scored should show evidence of significant toxicity, but without exceeding a top dose of 5000 µg/plate. Toxicity might be detected by a reduction in the number of revertants, and/or clearing or diminution of the background lawn.

권장되는 세균 균주 세트(OECD)에는 다음과 같이 염기치환 돌연변이와 틀이동 돌연변이를 검출하는 균주가 포함된다.

The recommended set of bacterial strains (OECD) includes those that detect base substitution and frameshift mutations as follows:

OECD 및 IWGT 권고사항과 다른 점 하나는, 의약품 시험 경험에 근거하여, 대사활성화 유무 조건에서 모든 균주, 최고 용량 선택 기준을 충족하는 적합한 용량 범위, 적절한 양성 및 음성 대조를 포함한 완전히 적절한 프로토콜로 수행하여 결과가 명확한 음성 또는 양성이면 단일 세균 돌연변이시험(에임스 시험)으로 충분한 것으로 간주한다는 점이다. 또한 의약품 시험의 경우 이 단일 실험에는 평판 혼입법 또는 전배양법 중 어느 것이든 적절한 것으로 간주된다(주석 7). 불명확하거나 약한 양성 결과는 용량 간격을 적절히 조정하는 등 변경된 프로토콜로 시험을 반복하는 것이 적절함을 시사할 수 있다.

One difference from the OECD and IWGT recommendations is that, based on experience with testing pharmaceuticals, a single bacterial mutation (Ames) test is considered sufficient when it is clearly negative or positive, and carried out with a fully adequate protocol including all strains with and without metabolic activation, a suitable dose range that fulfills criteria for top dose selection, and appropriate positive and negative controls. Also, for testing pharmaceuticals, either the plate incorporation or the pre-incubation method is considered appropriate for this single experiment (Note 7). Equivocal or weak positive results might indicate that it would be appropriate to repeat the test, possibly with a modified protocol such as appropriate spacing of dose levels.

프로토콜에 관한 권고는 OECD 가이드라인(1997)과 IWGT 간행물(예: Kirsch-Volders et al., 2003; Moore et al., 2006)에 제시되어 있다. 전체 평가 계수(global evaluation factor)의 사용을 포함하여 MLA 결과 해석에 관한 권고도 제시되어 있다(Moore et al., 2006). 의약품 시험과 관련하여, 특히 최고 농도 선택에 대해 이러한 권고사항과의 몇 가지 차이점을 여기에 기재한다. (아래 세부 사항 참조.)

Advice on the protocols is given in the OECD guidelines (1997) and the IWGT publications (e.g., Kirsch-Volders et al., 2003; Moore et al., 2006). Advice on interpretation of MLA results is also given (Moore et al., 2006), including use of a global evaluation factor. Several differences from these recommendations are noted here for testing pharmaceuticals, notably for selection of the top concentration. (See details below.)

용매나 배양배지에 대한 용해도 또는 세포독성에 의해 제한되지 않는 경우, 권장 최대 최고 농도는 1 mM 또는 0.5 mg/ml 중 낮은 쪽이다(주석 8).

The maximum top concentration recommended is 1 mM or 0.5 mg/ml, whichever is lower, when not limited by solubility in solvent or culture medium or by cytotoxicity (Note 8).

용해도가 제한 요인인 경우, 세포독성에 의해 제한되지 않는다면 최대 농도는 계수에 방해가 없는 범위에서 배양물에 최소한의 침전물이 보이는 가장 낮은 농도이어야 한다. 침전 평가는 육안 또는 광학현미경 검사와 같은 방법으로 할 수 있으며, 배양 중(처리 종료 시점까지) 지속되거나 나타나는 침전물을 기록한다.

When solubility is limiting, the maximum concentration, if not limited by cytotoxicity, should be the lowest concentration at which minimal precipitate is visible in cultures, provided there is no interference with scoring. Evaluation of precipitation can be done by naked eye or by methods such as light microscopy, noting precipitate that persists or appears during culture (by the end of treatment).

중기 염색체 이상 또는 소핵에 대한 시험관내 세포유전학적 시험의 경우, 세포독성은 세포 증식 약 50% 감소를 초과해서는 안 된다(주석 9 및 10). MLA의 경우 최고 용량에서 20-10%의 RTG로 측정되는 80-90%의 세포독성이 있어야 한다(주석 9).

For in vitro cytogenetic assays for metaphase chromosome aberrations or for micronuclei, cytotoxicity should not exceed a reduction of about 50% in cell growth (Notes 9 and 10). For the MLA, at the top dose there should be 80-90% cytotoxicity as measured by an RTG between 20-10% (Note 9).

시험관내 중기 세포의 염색체 손상에 대한 세포유전학적 평가에서 시험 프로토콜은 적절한 양성 및 음성 대조와 함께 대사활성화 유무 조건의 시험 수행을 포함하여야 한다. 시험물질 처리는 3~6시간 동안 하여야 하며, 표본 채취 시점은 처리 시작부터 정상 세포주기의 약 1.5배가 되는 시점이어야 한다. 대사활성화 유무 두 조건의 단기 처리에서 모두 음성 또는 불명확한 결과가 나온 경우, 정상 세포주기 약 1.5배의 표본 채취 시점까지 대사활성화 없이 연속 처리를 수행하여야 한다. 시험관내 소핵시험에도 같은 원칙이 적용되나, 세포가 유사분열을 완료하고 다음 간기로 들어갈 수 있도록 표본 채취 시점은 일반적으로 처리 시작부터 정상 세포주기의 1.5~2배이다.

For the cytogenetic evaluation of chromosomal damage in metaphase cells in vitro, the test protocol should include the conduct of tests with and without metabolic activation, with appropriate positive and negative controls. Treatment with the test articles should be for 3 to 6 hours with a sampling time approximately 1.5 normal cell cycles from the beginning of the treatment. A continuous treatment without metabolic activation up to the sampling time of approximately 1.5 normal cell cycles should be conducted in case of negative or equivocal results for both short treatments, with and without metabolic activation. The same principles apply to the in vitro micronucleus assay, except that the sampling time is typically 1.5 to 2 normal cell cycles from the beginning of treatment to allow cells to complete mitosis and enter the next interphase.

두 시험관내 세포유전학적 시험 모두, 더 긴 처리, 지연된 표본 채취 시점 또는 회복 기간을 두면 더 쉽게 검출될 수 있는 특정 유형의 화학물질(예: 일부 뉴클레오시드 유사체 및 일부 니트로사민)에 대해서는 프로토콜을 변경할 필요가 있을 수 있다. 중기 염색체 이상시험에서는 배수체(핵내 복제 포함) 중기상의 발생률을 중기 세포 수에 대한 백분율로 기록하여 배수성 상태에 관한 정보를 얻어야 한다. MLA의 경우 시험 프로토콜은 적절한 양성 및 음성 대조와 함께 대사활성화 유무 조건의 시험 수행을 포함하여야 하며, 시험물질 처리는 3~4시간 동안 한다. 대사활성화 유무 두 조건의 단기 처리에서 모두 음성 또는 불명확한 결과가 나온 경우, 대사활성화 없이 약 24시간 연속 처리를 수행하여야 한다.

For both in vitro cytogenetic assays, there might be a need to modify the protocol for certain types of chemicals that could be more readily detected by longer treatment, delayed sampling times or recovery periods, e.g., some nucleoside analogues and some nitrosamines. In the metaphase aberration assay, information on the ploidy status should be obtained by recording the incidence of polyploid (including endoreduplicated) metaphases as a percentage of the number of metaphase cells. For MLA, the test protocol should include the conduct of tests with and without metabolic activation, with appropriate positive and negative controls, where the treatment with the test article is for 3 to 4 hours. A continuous treatment without metabolic activation for approximately 24 hours should be conducted in case of a negative or equivocal result for both short treatments, with and without metabolic activation.

표준 MLA에는 (i) 주로 소형 콜로니를 유발하는 양성 대조의 포함과 (ii) 양성 대조, 용매 대조 및 적어도 하나의 양성 시험물질 농도(있는 경우)에 대한 콜로니 크기 측정이 포함되어야 하며, 여기에는 돌연변이 빈도가 가장 높았던 배양물이 포함되어야 한다.

A standard MLA should include (i) the incorporation of positive controls that induce mainly small colonies, and (ii) colony sizing for positive controls, solvent controls and at least one positive test compound concentration (should any exist), including the culture that gave the greatest mutant frequency.

시험관내 포유류 세포 시험에서는 위에 기술한 것과 같은 내장된 확인 요소(예: 서로 다른 처리 기간, 대사활성화 유무 조건의 시험)를 사용하여야 한다. 이러한 시험 후 결과가 명확한 음성 또는 양성이면 추가 확인 시험은 보통 필요하지 않다. 불명확하거나 약한 양성 결과는 시험 농도 간격을 적절히 조정하는 등 변경된 프로토콜로 시험을 반복해야 할 수 있다.

For mammalian cell assays in vitro, built-in confirmatory elements, such as those outlined above (e.g., different treatment lengths, tests with and without metabolic activation), should be used. Following such testing, further confirmatory testing in the case of clearly negative or positive test results is not usually warranted. Equivocal or weak positive results might call for repeating tests, possibly with a modified protocol such as appropriate spacing of the test concentrations.

동시 양성 대조는 중요하지만, 시험관내 포유류 세포 유전독성시험은 충분히 표준화되어 있으므로, 양성 대조의 사용은 일반적으로 대사활성화 시스템의 활성과 시험계의 반응성을 입증하기 위한 대사활성화 조건의 양성 대조 하나(비활성화 시험과 동시에 수행하는 경우)로 한정할 수 있다.

Concurrent positive controls are important, but in vitro mammalian cell tests for genetic toxicity are sufficiently standardized that use of positive controls can generally be confined to a positive control with metabolic activation (when it is done concurrently with the non-activated test) to demonstrate the activity of the metabolic activation system and the responsiveness of the test system.

생체내 골수 세포에서의 염색체 이상 분석 또는 소핵 다염성 적혈구 측정 중 어느 것이든 염색체 절단물질 검출에 적절한 것으로 간주된다. 랫드와 마우스 모두 골수 소핵시험에 사용하기에 적절한 것으로 간주된다. 소핵은 마우스 말초혈액의 미성숙(예: 다염성) 적혈구 또는 랫드 혈액의 새로 형성된 망상적혈구에서도 측정할 수 있다(주석 3). 마찬가지로 골수 또는 말초혈액에서 염색체 절단물질/이수성 유발물질을 검출하는 데 적절한 민감도를 보인 다른 동물종의 미성숙 적혈구도 사용할 수 있다(주석 3). 자동 분석 시스템(영상 분석 및 유세포 분석)은 적절히 밸리데이션된 경우 사용할 수 있다(OECD, 1997; Hayashi et al., 2000; 2007). 염색체 이상은 투여한 설치류에서 배양한 말초 림프구에서도 분석할 수 있다(주석 11).

Either the analysis of chromosomal aberrations or the measurement of micronucleated polychromatic erythrocytes in bone marrow cells in vivo is considered appropriate for the detection of clastogens. Both rats and mice are considered appropriate for use in the bone marrow micronucleus test. Micronuclei can also be measured in immature (e.g., polychromatic) erythrocytes in peripheral blood in the mouse, or in the newly formed reticulocytes in rat blood (Note 3). Likewise, immature erythrocytes can be used from any other species which has shown an adequate sensitivity to detect clastogens/aneuploidy inducers in bone marrow or peripheral blood (Note 3). Systems for automated analysis (image analysis and flow cytometry) can be used if appropriately validated (OECD, 1997; Hayashi et al., 2000; 2007). Chromosomal aberrations can also be analyzed in peripheral lymphocytes cultured from treated rodents (Note 11).

표준 시험조합(옵션 2)에서 두 번째 시험으로 기술한 것과 같은 생체내 시험을 후속 시험으로 사용하여 시험관내 또는 생체내 시험 결과를 평가하는 데 필요한 증거 가중(weight of evidence)을 확보할 수 있다(주석 11 및 12). 시험관내에서 관찰된 영향의 유형과 작용기전에 관한 지식은 생체내 시험 선택의 지침이 될 수 있으나, 대부분의 조직에서 표준 방법으로 내재 유전자의 염색체 이상이나 유전자 돌연변이를 조사하는 것은 실행 가능하지 않다. 설치류의 도입유전자(transgene)에서 돌연변이를 측정할 수는 있으나, 특히 세포분열이 적은 조직에서는 돌연변이의 발현, 고정 및 축적이 일어나도록 장기간 투여(예: 28일)가 필요하다(주석 12). 따라서 두 번째 생체내 시험은 흔히 대리 지표로서 DNA 손상 평가변수를 평가하게 된다.

The same in vivo tests described as the second test in the standard battery (Option 2) can be used as follow-up tests to develop weight of evidence in assessing results of in vitro or in vivo assays (Notes 11 and 12). While the type of effect seen in vitro and any knowledge of the mechanism can help guide the choice of in vivo assay, investigation of chromosomal aberrations or of gene mutations in endogenous genes is not feasible with standard methods in most tissues. Although mutation can be measured in transgenes in rodents, this entails prolonged treatment (e.g., 28 days) to allow for mutation expression, fixation and accumulation, especially in tissues with little cell division (Note 12). Thus the second in vivo assay will often evaluate a DNA damage endpoint as a surrogate.

공표된 경험과 시험계획에 관한 권고가 가장 많이 축적된 시험으로는 단세포 겔 전기영동("코멧(Comet)") 시험 및 알칼리 용출 시험과 같은 DNA 가닥 절단 시험, 생체내 형질전환 마우스 돌연변이 시험 및 DNA 공유결합 시험(이들은 모두 여러 조직에 적용할 수 있다. 주석 12), 그리고 간 비예정 DNA 합성(unscheduled DNA synthesis, UDS) 시험이 있다.

Assays with the most published experience and advice on protocols include the DNA strand break assays such as the single cell gel electrophoresis (“Comet”) assay and alkaline elution assay, the in vivo transgenic mouse mutation assays and DNA covalent binding assays, (all of which may be applied in many tissues, Note 12), and the liver unscheduled DNA synthesis (UDS) assay.

일반적으로 3개 용량 단계를 분석한다(Hayashi et al., 2005).

Typically three dose levels are analyzed (Hayashi et al., 2005).

단기(통상 1~3회 투여) 시험의 경우, 유전독성시험에 권장되는 최고 용량은 내약성이 있다면 한계용량인 2000 mg/kg이고, 그렇지 않으면 최대 내약 용량이며, 최대 내약 용량은 (예를 들어 소핵시험에 대해(OECD)) 같은 투여 요법에 근거하여 그보다 높은 용량에서는 치사가 예상될 정도의 독성 징후를 나타내는 용량으로 정의된다. 코멧 시험(Hartmann et al., 2003)과 형질전환 돌연변이 시험(Heddle et al., 2000)에 대해서도 유사한 권고가 제시되었다. 용량 선택 시 골수의 적혈구 생성 억제도 고려하여야 한다. 그보다 낮은 용량은 일반적으로 이 용량 아래로 약 2~3배 간격을 둔다.

For short-term (usually 1 to 3 administrations) studies, the top dose recommended for genotoxicity assays is a limit dose of 2000 mg/kg, if this is tolerated, or a maximum tolerated dose defined (for example for the micronucleus assay (OECD)) as the dose producing signs of toxicity such that higher dose levels, based on the same dosing regimen, would be expected to produce lethality. Similar recommendations have been made for the Comet assay (Hartmann et al., 2003) and transgenic mutation assay (Heddle et al., 2000). Suppression of bone marrow red blood cell production should also be taken into account in dose selection. Lower doses are generally spaced at approximately two to three fold intervals below this.

생체내 유전독성시험을 반복 투여 독성시험에 통합하는 경우, 해당 독성시험이 사람 임상시험을 뒷받침하기에 적절한 시험의 기준을 충족하면 그 용량은 일반적으로 적절한 것으로 간주된다. 이는 생체내 소핵시험에 관한 OECD 가이드라인의 용량 선택 기준과 다를 수 있다. 이는 시험관내 포유류 세포 시험이 음성(또는 "관련성 없는 양성", 제5항 참조)인 경우에 적용된다.

When the in vivo genotoxicity test is integrated into a multiple administration toxicology study, the doses are generally considered appropriate when the toxicology study meets the criteria for an adequate study to support human clinical trials; this can differ from dose selection criteria in the OECD guideline for the in vivo micronucleus assay. This applies when the in vitro mammalian cell test is negative (or “non-relevant positive”; see Section 5).

유전독성의 징후를 규명하기 위해 후속 시험을 수행하거나 시험관내 포유류 세포 시험 없이 옵션 2를 사용하는 경우, 최고 용량이 유전독성 평가에 적절한지 판단하기 위해 여러 요인을 평가하여야 한다. 아래 기준 중 어느 하나라도 충족하면 독성시험(통상 랫드)의 최고 용량이 소핵 분석 및 기타 유전독성 평가에 적절함을 입증하기에 충분한 것으로 간주된다.

When carrying out follow-up studies to address any indication of genotoxicity, or when using Option 2 with no in vitro mammalian cell assay, several factors should be evaluated to determine whether the top dose is appropriate for genotoxicity evaluation. Any one of the criteria listed below is considered sufficient to demonstrate that the top dose in a toxicology study (typically in rats) is appropriate for micronucleus analysis and for other genotoxicity evaluation:

1. 부형제 중 약물의 물리화학적 특성에 근거한 최대 투여가능용량(Maximum Feasible Dose, MFD)(단, 해당 부형제에서의 MFD가 급성 투여로 달성할 수 있는 용량과 유사하여야 한다. 주석 13).
2. 14일 이상 시험의 경우, 내약성이 있다면 한계용량 1000 mg/kg.
3. 노출의 정체/포화 도달 또는 화합물 축적에 의해 입증된 최대 가능 노출. 반대로 시간 경과에 따라 모약물 노출이 상당히 감소하면(예: 초기 노출 대비 ≥50% 감소) 해당 시험은 부적격이 될 수 있다(처음 며칠 이내에 채취한 혈액 검체가 있는 경우는 제외한다). 이러한 현상이 한쪽 성별에서 관찰되면, 관심 대사체에 대한 노출이 증가하지 않는 한 일반적으로 노출이 감소한 성별은 시험 종료 시 판독하지 않는다.
4. 다른 이유로 급성 투여 자료가 있는 경우, 최고 용량이 급성 투여에 사용할 최고 용량, 즉 최소 치사 용량에 가까운 용량의 ≥50%인 경우. (급성 투여 소핵시험의 최고 용량은 현재 OECD 지침에서 그 이상이면 치사가 예상되는 용량으로 기술되어 있으며, 다른 생체내 시험에 대해서도 유사한 지침이 제시되어 있다(예: Hartmann et al., 2003).)

1. Maximum Feasible Dose (MFD) based on physico-chemical properties of the drug in the vehicle (provided the MFD in that vehicle is similar to that achievable with acute administration; Note 13).
2. Limit dose of 1000 mg/kg for studies of 14 days or longer, if this is tolerated.
3. Maximal possible exposure demonstrated either by reaching a plateau/saturation in exposure or by compound accumulation. In contrast, substantial reduction in exposure to parent drug with time (e.g., ≥50% reduction from initial exposure) can disqualify the study (unless a blood sample taken in the first few days is available). If this is seen in one sex, generally the sex with reduced exposure would not be scored at the end of the study, unless there is enhanced exposure to a metabolite of interest.
4. Top dose is ≥50% of the top dose that would be used for acute administration, i.e., close to the minimum lethal dose, if such acute data are available for other reasons. (The top dose for acute administration micronucleus tests is currently described in OECD guidance as the dose above which lethality would be expected; similar guidance is given (e.g., Hartmann et al., 2003) for other in vivo assays.)

독성 없이 노출 배수(임상 노출 대비 배수)에만 근거하여 최고 용량을 선택하는 것은 충분한 타당성으로 간주되지 않는다.

Selection of a top dose based only on an exposure margin (multiple over clinical exposure) without toxicity is not considered sufficient justification.

강력한 방추체 독소(spindle poison)와 같이 이수성(aneuploidy)을 유발하는 많은 화합물은 골수 또는 혈액의 생체내 소핵시험에서 독성 용량에 근접한 좁은 용량 범위 내에서만 검출된다. 이는 일부 염색체 구조이상 유발물질(clastogen)에도 해당한다. 독성 자료가 적혈구 계열에 대한 심한 독성(예: 다염성 적혈구(Polychromatic Erythrocytes, PCE) 또는 망상적혈구의 현저한 억제)을 나타내면, 판독하는 용량은 최고 세포독성 용량 아래로 약 2배 이내의 간격을 두어야 한다. 수 주간의 시험에 적절한 용량이 포함되지 않은 경우, 이수성 유발물질(aneugen) 및 일부 독성 염색체 구조이상 유발물질의 검출에 기여할 수 있는 추가 자료는 다음 중 어느 하나로부터 얻을 수 있다.

Many compounds that induce aneuploidy, such as potent spindle poisons, are detectable in in vivo micronucleus assays in bone marrow or blood only within a narrow range of doses approaching toxic doses. This is also true for some clastogens. If toxicological data indicate severe toxicity to the red blood cell lineage (e.g., marked suppression of Polychromatic Erythrocytes (PCEs) or reticulocytes), doses scored should be spaced not more than about 2 fold below the top, cytotoxic dose. If suitable doses are not included in a multi-week study, additional data that could contribute to the detection of aneugens and some toxic clastogens could be derived from any one of the following:

1. 투여 기간이 길어짐에 따라 독성이 현저히 증가하는 경우에는 조기 혈액 채취(3~4일째)가 권장된다. 예를 들어 수 주간의 시험(예: 28일)에서 소핵 측정에 혈액 또는 골수를 사용하고 망상적혈구를 판독하는 경우, 현저한 혈액독성은 소핵 검출 능력에 영향을 줄 수 있다. 즉, 급성 투여 후 검출 가능한 소핵 증가를 유발하는 용량이 반복 투여 후에는 독성이 너무 커서 분석할 수 없을 수 있다(Hamada et al., 2001). 조기 검체는 염색체 구조이상 유발물질과 잠재적 이수성 유발물질이 검출된다는 보증을 제공하는 데 사용할 수 있다(단, 주석 14 및 15 참조).
2. 시험관내 포유류 세포 소핵시험.
3. 급성 골수 소핵시험.

1. Early blood sampling (at 3-4 days) is advisable when there are marked increases in toxicity with increasing treatment time. For example, when blood or bone marrow is used for micronucleus measurement in a multiweek study (e.g., 28 days), and reticulocytes are scored, marked hematotoxicity can affect the ability to detect micronuclei; i.e., a dose that induces detectable increases in micronuclei after acute treatment might be too toxic to analyze after multiple treatments (Hamada et al., 2001). The early sample can be used to provide assurance that clastogens and potential aneugens are detected (but see Notes 14 and 15).
2. An in vitro mammalian cell micronucleus assay.
3. An acute bone marrow micronucleus assay.

생체내 시험은 유전독성시험 전략에서 중요한 역할을 한다. 생체내 결과의 가치는 표적 조직이 시험물질에 적절히 노출되었음을 입증하는 것과 직접 관련된다. 이는 시험관내 시험에서 유전독성의 설득력 있는 증거가 나타났거나 시험관내 포유류 세포 시험을 사용하지 않은 경우의 생체내 음성 결과에 특히 해당한다. 적절한 노출의 증거로는 해당 조직의 독성 또는 다음 항에 기술한 독성동태 자료가 포함될 수 있다.

In vivo tests have an important role in genotoxicity test strategies. The value of in vivo results is directly related to the demonstration of adequate exposure of the target tissue to the test compound. This is especially true for negative in vivo test results when in vitro test(s) have shown convincing evidence of genotoxicity, or when no in vitro mammalian cell assay is used. Evidence of adequate exposure could include toxicity in the tissue in question, or toxicokinetic data as described in the following section.

생체내 노출 평가는 유전독성시험에 사용한 것과 같은 동물종, 계통 및 투여 경로를 사용하여 최고 용량 또는 기타 관련 용량에서 수행하여야 한다. 독성시험에서 유전독성을 측정하는 경우, 노출 정보는 일반적으로 독성 평가의 일부로 확보된다.

Assessments of in vivo exposure should be made at the top dose or other relevant doses using the same species, strain and dosing route used in the genotoxicity assay. When genotoxicity is measured in toxicology assays, exposure information is generally available as part of the toxicology assessment.

생체내 노출의 입증은 다음 측정 중 어느 하나로 하여야 한다.

Demonstration of in vivo exposure should be made by any of the following measurements:

1. 세포독성: 세포유전학적 시험의 경우: 소핵시험에 사용한 용량 및 채취 시점에서 사용 조직(골수 또는 혈액) 내 전체 적혈구 중 미성숙 적혈구 비율의 유의한 변화를 얻거나, 염색체 이상 시험의 경우 유사분열지수의 유의한 감소를 측정한다.
2. 기타 생체내 유전독성시험의 경우: 예를 들어 병리조직학적 평가 또는 혈액생화학적 독성 지표에 의한 간 또는 평가 대상 조직의 독성.

1. Cytotoxicity: For cytogenetic assays: By obtaining a significant change in the proportion of immature erythrocytes among total erythrocytes in the tissue used (bone marrow or blood) at the doses and sampling times used in the micronucleus test or by measuring a significant reduction in mitotic index for the chromosomal aberration assay.
2. For other in vivo genotoxicity assays: Toxicity in the liver or tissue being assessed, e.g., by histopathological evaluation or blood biochemistry toxicity indicators.

전신 노출이 예상 임상 노출과 유사하거나 그보다 낮으면 다음과 같은 대체 전략이 필요할 수 있다.

If systemic exposure is similar to or lower than expected clinical exposure, alternative strategies might be called for such as:

1. 다른 투여 경로의 사용;
2. 노출이 더 높은 다른 동물종의 사용;
3. 다른 조직 또는 시험의 사용(2.3.4항 "표준 생체내 시험 사용의 한계" 참조).

1. Use of a different route of administration;
2. Use of a different species with higher exposure;
3. Use of a different tissue or assay (see Section 2.3.4, “Limitations to the use of standard in vivo tests”).

적절한 노출을 달성할 수 없는 경우(예: 표적 조직 이용률이 매우 낮은 화합물) 통상적인 생체내 유전독성시험은 가치가 거의 없다.

When adequate exposure cannot be achieved (e.g., with compounds showing very poor target tissue availability) conventional in vivo genotoxicity tests have little value.

시험관내 시험에서 유전독성 가능성이 나타나지 않으면, 생체내(전신) 노출은 위의 방법 중 어느 하나로 평가하거나, 다른 목적으로 설치류에서 수행한 표준 흡수·분포·대사·배설(Absorption, Distribution, Metabolism and Excretion, ADME) 시험 결과로부터 추정할 수 있다.

If in vitro tests do not show genotoxic potential, in vivo (systemic) exposure can be assessed by any of the methods above, or can be assumed from the results of standard Absorption, Distribution, Metabolism and Excretion (ADME) studies in rodents done for other purposes.

생체내 소핵(Micronucleus, MN) 시험, 염색체 이상 시험 및 UDS 시험의 검체 채취 시점 선택은 OECD(1997)를 따라야 한다.

Selection of the sampling time in the in vivo Micronucleus (MN), chromosomal aberration and UDS test should follow OECD (1997).

소핵 분석을 수 주간의 시험에 통합하는 경우, 혈액 또는 골수의 채취는 마지막 투여 다음 날에 할 수 있다(위의 추가 혈액 채취 시점에 관한 권고 참조).

When micronucleus analysis is integrated into multi-week studies, sampling of blood or bone marrow can be done the day after the final administration (see recommendation for additional blood sampling time above).

기타 유전독성시험의 경우, 검체 채취 시점은 측정하는 평가변수에 적합하게 선택하여야 한다. 예를 들어 1일 반복 투여의 경우 DNA 손상/가닥 절단 측정은 통상 마지막 투여 후 몇 시간(예: 2~6시간) 뒤에 한다. 단회 투여의 경우에는 투여 후 몇 시간과 24시간의 두 채취 시점을 사용하여야 한다.

For other genotoxicity assays, sampling time should be selected as appropriate for the endpoint measured; for example, DNA damage/strand break measurements are usually made a few (e.g., 2-6) hours after the last administration for the multiple daily administration. In the case of single administration, two sampling times should be used: a few hours and 24 hours after the treatment.

원칙적으로, 최고 용량/노출이 적절하다면 어떤 기간의 시험이든 적절한 것으로 간주할 수 있다.

In principle, studies of any length can be considered appropriate, provided the top dose/exposure is adequate.

분석하는 동물 수는 소핵시험(OECD) 또는 기타 유전독성시험에 관한 현행 권고에 따라 정하며, 일반적으로 독성시험에서 투여한 동물 전체를 포함하지는 않는다. 유전독성 분석에 사용하는 동물은 독성시험에 사용한 군에서 무작위로 선택하여야 한다.

The number of animals analyzed is determined by current recommendations for the micronucleus assay (OECD) or other genotoxicity assays and generally does not include all the animals treated for a toxicology study. Animals used for genotoxicity analyses should be randomly selected from the group used for the toxicology study.

성별 특이적 약물을 시험하는 경우에는 해당 성별에서 시험을 수행할 수 있다. 급성 시험계획에 따른 생체내 시험은 일반적으로 한쪽 성별에서만 수행할 수 있다. 급성 시험의 경우, 기존의 독성, 대사 또는 노출(Cmax 또는 AUC) 자료가 사용 동물종에서 독성학적으로 의미 있는 성별 차이를 나타내는 경우에만 양쪽 성별을 고려하여야 한다. 그렇지 않으면 급성 유전독성시험에는 수컷만 사용하는 것이 적절한 것으로 간주된다. 유전독성시험을 양쪽 성별의 반복투여 독성시험에 통합하는 경우, 양쪽 성별에서 검체를 채취할 수 있으나 독성/대사에서 뚜렷한 성별 차이가 없으면 한쪽 성별만 판독할 수 있다. 판독하는 성별의 용량 단계는 적절한 용량 단계의 기준을 충족하여야 한다(4.3.2항 및 4.3.3항 참조).

If sex-specific drugs are to be tested, then the assay can be done in the appropriate sex. In vivo tests with the acute protocol can generally be carried out in only one sex. For acute tests, both sexes should be considered only if any existing toxicity, metabolism or exposure (Cmax or AUC) data indicate a toxicologically meaningful sex difference in the species being used. Otherwise, the use of males alone is considered appropriate for acute genotoxicity tests. When the genotoxicity test is integrated into a repeat-dose toxicology study in two sexes, samples can be collected from both sexes, but a single sex can be scored if there is no substantial sex difference evident in toxicity/metabolism. The dose levels for the sex(es) scored should meet the criteria for appropriate dose levels (see Sections 4.3.2 and 4.3.3).

확립된 다른 생체내 유전독성시험에도 유사한 원칙을 적용할 수 있다.

Similar principles can be applied for other established in vivo genotoxicity tests.

투여 경로는 일반적으로 예상 임상 경로(예: 경구, 정맥 또는 피하)로 하나, 전신 노출을 얻기 위해 적절한 경우(예: 국소 적용 화합물) 변경할 수 있다(2.3.4항 참조).

The route of administration is generally the expected clinical route, e.g., oral, intravenous or subcutaneous, but can be modified if appropriate in order to obtain systemic exposure, e.g., for topically applied compounds (see Section 2.3.4).

생체내 시험의 경우, 시험기관이 해당 시험의 사용 역량을 확립한 후에는 매 시험마다 동시에 하지 않고 주기적으로만 양성대조물질을 동물에 투여하는 것으로 충분한 것으로 간주된다(주석 16).

For in vivo studies, it is considered sufficient to treat animals with a positive control only periodically, and not concurrently with every assay, after a laboratory has established competence in the use of the assay (Note 16).

비교 시험 결과, 각 시험관내 시험계는 설치류 발암성 예측과 관련하여 위음성과 위양성 결과를 모두 낸다는 것이 결정적으로 입증되었다. (시험관내 및 생체내 시험으로 구성된) 유전독성시험 조합은 알려진 사람 발암물질의 대부분과 같이 주로 직접적인 유전적 손상을 수반하는 기전으로 작용한다고 생각되는 발암물질을 검출한다. 따라서 이러한 시험조합이 비유전독성 발암물질을 검출할 것으로 기대되지는 않는다. 시험관내 대사활성화계의 제한된 능력과 같은 실험 조건은 시험관내 시험에서 위음성 결과를 초래할 수 있다. 시험조합 접근방식은 유전독성 가능성이 있는 화합물에 대한 위음성 결과의 위험을 줄이도록 설계되었다. 반면에 어떤 유전독성시험에서의 양성 결과가 항상 시험물질이 사람에게 유전독성/발암 위해를 일으킨다는 것을 의미하지는 않는다.

Comparative trials have shown conclusively that each in vitro test system generates both false negative and false positive results in relation to predicting rodent carcinogenicity. Genotoxicity test batteries (of in vitro and in vivo tests) detect carcinogens that are thought to act primarily via a mechanism involving direct genetic damage, such as the majority of known human carcinogens. Therefore, these batteries are not expected to detect non-genotoxic carcinogens. Experimental conditions, such as the limited capability of the in vitro metabolic activation systems, can lead to false negative results in in vitro tests. The test battery approach is designed to reduce the risk of false negative results for compounds with genotoxic potential. On the other hand a positive result in any assay for genotoxicity does not always mean that the test compound poses a genotoxic/carcinogenic hazard to humans.

시험관내 양성 자료는 약물의 고유한 유전독성 특성을 나타낼 수 있으나, 대부분의 경우 이러한 시험관내 신호의 생물학적 의의는 적절한 생체내 자료가 결정한다. 또한 특정 농도 이상에서만 작용하는 간접적인 유전독성 기전이 여럿 있으므로, 그러한 기전의 증거가 있는 약물 계열에 대해서는 안전 수준(역치)을 설정하는 것이 가능하다(아래 5.2 참조, Müller and Kasper, 2000; Scott et al., 1991; Thybaud et al., 2007).

Although positive in vitro data could indicate intrinsic genotoxic properties of a drug, appropriate in vivo data determine the biological significance of these in vitro signals in most cases. Also, because there are several indirect mechanisms of genotoxicity that operate only above certain concentrations, it is possible to establish a safe level (threshold) for classes of drugs with evidence for such mechanisms (see 5.2. below, Müller and Kasper, 2000; Scott et al., 1991; Thybaud et al., 2007).

아래 권고는 시험이 적절한 용량 간격, 독성 수준 등을 사용하여 수행되었다고 가정한다.

The recommendations below assume that the test has been conducted using appropriate spacing of doses, levels of toxicity etc.

시험관내 또는 생체내에서 외견상 유전독성의 작은 증가는 먼저 재현성과 생물학적 의의를 평가하여야 한다. 생물학적으로 의미 있다고 간주되지 않는 결과의 예는 다음과 같다.

Small increases in apparent genotoxicity in vitro or in vivo should first be assessed for reproducibility and biological significance. Examples of results that are not considered biologically meaningful include:

1. 음성대조 또는 용매대조 값과 비교하여 통계적으로 유의하지만 해당 시험시설의 적절한 과거 대조값의 신뢰구간 이내에 있는 작은 증가.
2. 재현되지 않는 약한/불분명한 반응.

1. Small increases that are statistically significant compared with the negative or solvent control values but are within the confidence intervals of the appropriate historical control values for the testing facility.
2. Weak/equivocal responses that are not reproducible.

위 조건 중 어느 하나라도 해당하면, 증거 가중은 유전독성 가능성이 없음을 나타내며, 해당 시험은 음성 또는 그 소견은 생물학적으로 관련성이 없는 것으로 간주되고, 추가 시험은 필요하지 않다.

If either of the above conditions applies, the weight of evidence indicates a lack of genotoxic potential, the test is considered negative or the findings not biologically relevant, and no further testing is called for.

양성 결과, 특히 미생물 돌연변이원성 시험의 양성 결과를 평가할 때에는 그 양성 결과가 오염물질에 기인할 수 있는지 판단하기 위해 시험물질의 순도를 고려하여야 한다.

In evaluating positive results, especially for the microbial mutagenicity test, the purity of the test compound should be considered, to determine whether the positive result could be attributable to a contaminant.

에임스 시험(복귀돌연변이시험)의 양성 결과는 DNA 반응성을 나타내는 것으로 여겨지므로, 적절한 위해-유익성 분석으로 타당성이 입증되지 않는 한, 환자 투여 시의 잠재적 위험을 평가하기 위해 생체내 돌연변이 유발 및 발암 가능성을 평가하는 광범위한 후속 시험이 필요할 것이다.

Since positive results in the Ames test are thought to indicate DNA reactivity, extensive follow-up testing to assess the in vivo mutagenic and carcinogenic potential would be warranted to assess the potential risk for treatment of patients, unless justified by appropriate risk-benefit analysis.

실제 복귀돌연변이체가 아닌 집락이 인위적으로 증가하는 것으로 잘 규명된 사례가 일부 있다. 이는 아미노산 오염(즉, Salmonella typhimurium 균주에 히스티딘, 또는 Escherichia coli 균주에 트립토판을 공급)으로 인해 일어날 수 있으므로, 세균 복귀돌연변이 시험은 분해될 가능성이 있는 펩타이드의 시험에는 적합하지 않다. 예를 들어 세균 니트로환원효소에 의한 활성화와 같은 세균 특이적 대사가 일어나는 경우처럼, 세균 돌연변이 시험의 양성 결과가 사람에서의 생체내 유전독성 가능성을 나타내지 않는 것으로 밝혀질 수 있는 경우가 있다.

There are some well characterized examples of artifactual increases in colonies that are not truly revertants. These can occur due to contamination with amino acids (i.e., providing histidine for Salmonella typhimurium strains or tryptophan for Escherichia coli strains), so that the bacterial reversion assay is not suitable for testing a peptide that is likely to degrade. Certain cases exist where positive results in bacterial mutation assays might be shown not to indicate genotoxic potential in vivo in humans, for example when bacterial-specific metabolism occurs, such as activation by bacterial nitroreductases.

양성 유전독성 결과에 대한 증거 가중 평가 및 후속 시험에 관한 권고는 IWGT 보고서(예: Thybaud et al., 2007)에서 논의되어 있다. 또한 과학 문헌에는 관련성이 의심스러운 시험관내 양성 결과를 초래할 수 있는 여러 조건이 제시되어 있다. 따라서 모든 시험관내 양성 결과는 아래에 제시한 바와 같이 증거 가중 평가에 근거하여 평가하여야 한다. 이 목록은 모든 경우를 망라한 것이 아니며 의사결정을 돕기 위해 제시한 것이다.

Recommendations for assessing weight of evidence and follow-up testing for positive genotoxicity results are discussed in IWGT reports (e.g., Thybaud et al., 2007). In addition, the scientific literature gives a number of conditions that can lead to a positive in vitro result of questionable relevance. Therefore, any in vitro positive test result should be evaluated based on an assessment of the weight of evidence as indicated below. This list is not exhaustive, but is given as an aid to decision-making.

1. 해당 조건이 생체내에서는 발생하지 않는다(pH, 삼투질농도, 침전물). (1 mM 한계는 삼투질농도의 증가를 방지하며, 시험물질이 pH를 변화시키면 처리 시점에 pH를 미처리 배양의 정상 pH로 조정하는 것이 권장됨에 유의한다.)
2. 영향이 가장 독성이 큰 농도에서만 나타난다. 마우스 림프종 시험(MLA)에서는 상대총성장률(RTG)이 ≥80% 감소한 농도에서의 증가. 시험관내 세포유전학적 시험에서는 성장이 ≥50% 억제된 경우.

1. The conditions do not occur in vivo (pH; osmolality; precipitates). (Note that the 1 mM limit avoids increases in osmolality, and that if the test compound alters pH it is advisable to adjust pH to the normal pH of untreated cultures at the time of treatment).
2. The effect occurs only at the most toxic concentrations. In the MLA increases at ≥80% reduction in RTG. For in vitro cytogenetics assays when growth is suppressed by ≥50%.

위 조건 중 어느 하나라도 해당하면 증거 가중은 유전독성 가능성이 없음을 나타내며, 표준 시험조합(옵션 1)을 따를 수 있다. 따라서 단일 생체내 시험으로 충분한 것으로 간주된다.

If any of the above conditions apply the weight of evidence indicates a lack of genotoxic potential; the standard battery (Option 1) can be followed. Thus, a single in vivo test is considered sufficient.

시험관내 음성 결과의 경우, 다음과 같은 특별한 경우에는 추가 시험을 고려하여야 한다(제시한 예는 모든 경우를 망라한 것이 아니며 의사결정을 돕기 위해 제시한 것이다). 화합물의 구조 또는 알려진 대사가 시험관내 대사활성화의 표준 기법(예: 설치류 간 S9)이 부적절할 수 있음을 나타내는 경우, 화합물의 구조 또는 알려진 활성이 다른 시험방법/시험계의 사용이 적절할 수 있음을 나타내는 경우.

For in vitro negative results further testing should be considered in special cases, such as (the examples given are not exhaustive, but are given as an aid to decision-making): The structure or known metabolism of the compound indicates that standard techniques for in vitro metabolic activation (e.g., rodent liver S9) might be inadequate; the structure or known activity of the compound indicates that the use of other test methods/systems might be appropriate.

생체내 시험은 흡수, 분포 및 배설을 고려할 수 있다는 장점이 있는데, 이는 시험관내 시험에서는 요인이 되지 않지만 사람에서의 사용과 잠재적으로 관련이 있다. 또한 대사는 시험관내에서 통상 사용하는 시험계에 비해 생체내에서 더 관련성이 높을 가능성이 있다. 생체내 결과와 시험관내 결과가 일치하지 않으면, 그 차이를 사례별로 고려/설명하여야 한다(예: 대사의 차이, 생체내에서 화합물의 빠르고 효율적인 배설).

In vivo tests have the advantage of taking into account absorption, distribution and excretion, which are not factors in in vitro tests, but are potentially relevant to human use. In addition metabolism is likely to be more relevant in vivo compared to the systems normally used in vitro. If the in vivo and in vitro results do not agree, then the difference should be considered/explained on a case-by-case basis, e.g., a difference in metabolism; rapid and efficient excretion of a compound in vivo.

생체내 유전독성시험도 진정한 유전독성을 나타내지 않는 오도된 양성 결과를 낼 가능성이 있다. 예를 들면 다음과 같다.

In vivo genotoxicity tests also have the potential to give misleading positive results that do not indicate true genotoxicity. As examples:

1. 소핵의 증가는 적혈구 생성의 교란으로 인해 유전독성 물질을 전혀 투여하지 않아도 일어날 수 있다(Tweats et al., 2007, I).
2. DNA 부가체 자료는 알려진 내재성 부가체의 배경 수준에 비추어 해석하여야 한다.
3. 독성과 관련된 간접적인 영향이 DNA 가닥 절단 시험(예: 알칼리 용출 시험 및 코멧 시험)의 결과에 영향을 줄 수 있다.

1. Increases in micronuclei can occur without administration of any genotoxic agent, due to disturbance in erythropoiesis (Tweats et al., 2007, I).
2. DNA adduct data should be interpreted in the light of the known background level of endogenous adducts.
3. Indirect, toxicity-related effects could influence the results of the DNA strand break assays (e.g., alkaline elution and Comet assays).

따라서 유전독성 자료를 평가할 때에는 모든 독성학적 및 혈액학적 소견을 고려하는 것이 중요하다(주석 15). 독성학적 변화와 관련된 간접적인 영향은 안전역을 가질 수 있으며 임상적으로 관련이 없을 수 있다.

Thus it is important to take into account all the toxicological and hematological findings when evaluating the genotoxicity data (Note 15). Indirect effects related to toxicological changes could have a safety margin and might not be clinically relevant.

다음 논의는 에임스 세균 돌연변이 시험의 결과가 음성이라고 가정한다.

The following discussion assumes negative results in the Ames bacterial mutation assay.

관련성이 없음을 나타내는 증거 가중이 불충분한 경우, 포유류 세포 시험 양성에 대해 권장되는 후속 조치는 다음과 같이 추가 시험관내 시험(아래 i) 또는 적절한 생체내 시험 2건의 수행(아래 ii)으로 실험적 증거를 제공하는 것이다.

When there is insufficient weight of evidence to indicate lack of relevance, recommended follow-up for positive mammalian cell assays would be to provide experimental evidence, either by additional in vitro studies (i, below) or by carrying out two appropriate in vivo assays (ii, below), as follows:

1. 관련 유전독성이 없다는 증거 가중에 기여하는 기전 정보는 흔히 시험관내에서 생성되며, 그 예로는 MLA에서 염색체 이상 또는 돌연변이를 유발하는 시험물질이 DNA 손상 물질이 아니라는 증거(예: 에임스 시험 외의 다른 음성 돌연변이/DNA 손상 시험, 구조적 고려사항), 또는 생체내에서 관련이 없거나 역치가 있을 수 있는 간접 기전의 증거(예: DNA 합성 저해, 고농도에서만 생성되는 활성산소종)가 있다(Galloway et al., 1998; Scott et al., 1991; Müller and Kasper, 2000).

   Mechanistic information that contributes to a weight of evidence for a lack of relevant genotoxicity is often generated in vitro, for example evidence that a test compound that induces chromosome aberrations or mutations in the MLA is not a DNA damaging agent (e.g., other negative mutation/DNA damage tests in addition to the Ames test; structural considerations), or evidence for an indirect mechanism that might not be relevant in vivo or might have a threshold (e.g., inhibition of DNA synthesis, reactive oxygen species produced only at high concentrations) (Galloway et al., 1998; Scott et al., 1991; Müller and Kasper, 2000).

   시험관내 소핵시험의 양성 결과에 대한 후속 조치에도 유사한 시험을 사용할 수 있으며, 이 경우 증거에는 염색체 소실/이수성을 나타내는 알려진 기전, 또는 염색체 소실을 나타내는 동원체 염색 실험(주석 17)이 포함될 수 있다. 배수성(polyploidy)은 시험관내 염색체 이상 시험에서 흔한 소견이다. 이수성 유발물질이 배수성을 유발할 수 있으나, 배수성 단독으로는 이수성 유발 가능성을 나타내지 않으며 단순히 세포주기 교란을 나타낼 수 있고, 세포독성 증가와도 흔히 관련된다. 시험관내 시험에서 구조적 염색체 절단 없이 배수성만 관찰되면, 일반적으로 적절한 노출이 보증된 생체내 소핵시험 음성 결과는 이수성 유발 가능성이 없다는 충분한 보증을 제공한다.

   Similar studies can be used to follow up a positive result in the in vitro micronucleus assay, or in this case evidence can include a known mechanism that indicates chromosome loss/aneuploidy, or centromere staining experiments (Note 17) that indicate chromosome loss. Polyploidy is a common finding in chromosome aberration assays in vitro. While aneugens can induce polyploidy, polyploidy alone does not indicate aneugenic potential and can simply indicate cell cycle perturbation; it is also commonly associated with increasing cytotoxicity. If polyploidy, but no structural chromosome breakage, is seen in an in vitro assay, generally a negative in vivo micronucleus assay with assurance of appropriate exposure would provide sufficient assurance of lack of potential for aneuploidy induction.

   위의 기전 정보와 증거 가중이 관련 유전독성이 없음을 뒷받침하면, 유전독성 활성이 없음을 확인하기 위해서는 노출에 대한 적절한 증거를 갖춘 단일 생체내 시험만 필요하다. 이는 통상 세포유전학적 시험이며, 염색체 소실 가능성에 대한 후속 조치에는 생체내 소핵시험이 필요하다. 관련 유전독성 가능성을 배제할 만한 증거 가중이나 기전 정보가 충분하지 않으면, 일반적으로 적절한 평가변수와 적절한 조직(통상 서로 다른 두 조직)에서 생체내 모델의 충분한 노출 확보에 중점을 둔 생체내 시험 2건이 필요하다.

   If the above mechanistic information and weight of evidence supports the lack of relevant genotoxicity, only a single in vivo test with appropriate evidence of exposure is called for in order to establish the lack of genotoxic activity. This is typically a cytogenetic assay, and the micronucleus assay in vivo is called for when following up potential for chromosome loss. If there is not sufficient weight of evidence or mechanistic information to rule out relevant genotoxic potential, two in vivo tests are generally called for, with appropriate endpoints and in appropriate tissues (usually two different tissues), and with an emphasis on obtaining sufficient exposure in the in vivo models.

또는

Or

1. 통상 서로 다른 조직을 사용하고 노출을 뒷받침하는 입증을 갖추어 적절한 생체내 시험 2건을 수행한다.

1. Two appropriate in vivo assays are done, usually with different tissues, and with supporting demonstration of exposure.

요약하면, 측정 평가변수에 대한 충분한 타당성과 노출 입증(4.4.1항 참조)을 갖춘 적절한 생체내 시험에서의 음성 결과는 유의한 유전독성 위험이 없음을 입증하기에 충분한 것으로 간주된다.

In summary, negative results in appropriate in vivo assays, with adequate justification for the endpoints measured and demonstration of exposure (see Section 4.4.1) are considered sufficient to demonstrate absence of significant genotoxic risk.

S9 활성화계 존재 하에서만 양성 결과가 관찰되는 경우, 그 원인이 대사활성화이며 다른 조건 차이(예: 비활성화 배양의 10% 혈청에 비해 S9 혼합액 중 혈청이 적거나 없음)가 아님을 먼저 확인하여야 한다. 그 다음 후속 전략은 시험관내 결과가 생체내 조건과 관련이 있는지 판단하는 것을 목표로 하며, 일반적으로 간에서의 생체내 시험에 중점을 둔다(주석 18).

When positive results are seen only in the presence of the S9 activation system, it should first be verified that metabolic activation is responsible and not some other difference in conditions (e.g., low or no serum in the S9 mix, compared with 10% serum in the non-activated incubations). The follow-up strategy is then aimed at determining the relevance of the results in vitro to conditions in vivo, and will generally focus on in vivo studies in liver (Note 18).

생체내에서 소핵이 증가하면, 비유전독성 영향이 그 원인이거나 기여 요인일 수 있는지 판단하기 위해 모든 독성 자료를 평가하여야 한다(주석 15). 적혈구 생성 교란 또는 생리 교란(저체온/고체온 등)에 의한 비특이적 영향이 의심되면, 생체내 염색체 이상 시험이 더 적절할 수 있다. "실제" 증가가 의심되면, 그 증가가 염색체 소실에 의한 것인지 염색체 절단에 의한 것인지 입증하는 전략을 사용하여야 한다(주석 17). 이수성 유발(예: 방추체 독소에 의한)이 비선형 용량반응을 따른다는 증거가 있다. 따라서 그 이하에서는 염색체 소실이 예상되지 않는 역치 노출이 있음을 판단하고, 임상 노출과 비교하여 적절한 안전역이 있는지 판단하는 것이 가능할 수 있다.

If there is an increase in micronuclei in vivo, all the toxicological data should be evaluated to determine whether a non-genotoxic effect could be the cause or a contributing factor (Note 15). If non-specific effects of disturbed erythropoiesis or physiology (such as hypo/hyperthermia) are suspected, an in vivo assay for chromosome aberrations might be more appropriate. If a “real” increase is suspected, strategies should be used to demonstrate whether the increase is due to chromosome loss or chromosome breakage (Note 17). There is evidence that aneuploidy induction, e.g., with spindle poisons, follows a non-linear dose response. Thus, it might be possible to determine that there is a threshold exposure below which chromosome loss is not expected and to determine whether an appropriate safety margin exists compared with clinical exposure.

결론적으로, 화합물의 유전독성 가능성 평가는 소견 전체를 고려하고 시험관내 시험과 생체내 시험 모두의 고유한 가치와 한계를 인정하여야 한다.

In conclusion, the assessment of the genotoxic potential of a compound should take into account the totality of the findings and acknowledge the intrinsic values and limitations of both in vitro and in vivo tests.

표준 시험조합에서는 음성이었으나 발암성 시험에서 종양 증가를 나타냈고 비유전독성 기전을 확립할 증거가 불충분한 화합물에 대해서는 적절한 모델로 추가 유전독성시험을 수행할 수 있다. 작용 양식의 이해를 돕기 위해, 추가 시험에는 시험관내 시험에서의 대사활성화 조건 변경을 포함하거나, DNA 가닥 절단 시험(예: 코멧 시험 또는 알칼리 용출 시험), 간 UDS 시험, DNA 공유결합(예: ³²P-후표지법), 도입유전자의 돌연변이 유발, 또는 종양 관련 유전자의 유전적 변화에 대한 분자적 특성분석과 같이 종양 유발 표적 장기에서 유전적 손상을 측정하는 생체내 시험을 포함할 수 있다(Kasper et al., 2007).

Additional genotoxicity testing in appropriate models can be conducted for compounds that were negative in the standard test battery but which have shown increases in tumors in carcinogenicity bioassay(s) with insufficient evidence to establish a non-genotoxic mechanism. To help understand the mode of action, additional testing can include modified conditions for metabolic activation in in vitro tests or can include in vivo tests measuring genetic damage in target organs of tumor induction, such as DNA strand break assays (e.g., comet or alkaline elution assays), liver UDS test, DNA covalent binding (e.g., by ³²P-postlabelling), mutation induction in transgenes, or molecular characterization of genetic changes in tumor-related genes (Kasper et al., 2007).

5. 특정한 구조경고 분자 실체(structurally alerting molecular entities)는 화학물질의 발암 및/또는 변이원 가능성과 인과적으로 관련되어 있는 것으로 인정된다. 구조경고의 예로는 알킬화 친전자성 중심, 불안정한 에폭사이드, 방향족 아민, 아조 구조, N-나이트로소기, 방향족 나이트로기가 있다(Ashby and Paton, 1994). 특정 구조경고를 가진 일부 화합물 계열에 대해서는 유전독성을 최적으로 검출하기 위하여 특정한 시험계획 변경/추가 시험이 중요하다는 것이 확립되어 있다(예: 아조기를 함유한 분자, 배당체, 활성화에 나이트로환원이 필요한 나이트로이미다졸 등의 화합물, 대사 활성화에 다른 설치류 S9가 필요한 페나세틴 등의 화합물).

5. Certain structurally alerting molecular entities are recognized as being causally related to the carcinogenic and/or mutagenic potential of chemicals. Examples of structural alerts include alkylating electrophilic centers, unstable epoxides, aromatic amines, azo-structures, N-nitroso groups, and aromatic nitro-groups (Ashby and Paton, 1994). For some classes of compounds with specific structural alerts, it is established that specific protocol modifications/additional tests are important for optimum detection of genotoxicity (e.g., molecules containing an azo-group, glycosides, compounds such as nitroimidazoles requiring nitroreduction for activation, compounds such as phenacetin requiring a different rodent S9 for metabolic activation).

6. 피부와 결장에서의 소핵 유발에 대한 생체내 시험에 관해서는 어느 정도 경험이 있으며(Hayashi et al., 2007), 이들 조직에서의 DNA 손상 시험도 적절한 대체 시험이 될 수 있다.

6. There is some experience with in vivo assays for micronucleus induction in skin and colon (Hayashi et al., 2007), and DNA damage assays in these tissues can also be an appropriate substitute.

7. 소수의 화학물질은 평판 혼합법(plate-incorporation) 또는 전배양법(pre-incubation) 중 한 가지로 더 쉽게 검출되나, 그 차이는 대개 정성적이라기보다 정량적이다(Gatehouse et al., 1994). 의약품을 두 시험계획 모두로 시험한 제약업계의 경험에서는 두 방법 간에 다른 결과가 나오지 않았으며, IWGT 보고서(Gatehouse et al., 1994)에서 전배양 시험계획으로 더 쉽게 검출된다고 열거한 화학물질 계열의 예는 대체로 의약품이 아니고 간에서의 생체내 유전독성시험에서 양성이다.

7. A few chemicals are more easily detectable either with plate-incorporation or with pre-incubation methods, though differences are typically quantitative rather than qualitative (Gatehouse et al., 1994). Experience in the pharmaceutical industry where drugs have been tested in both protocols has not resulted in different results for the two methods, and, in the IWGT report (Gatehouse et al., 1994), the examples of chemical classes listed as more easily detectable in the pre-incubation protocol are generally not pharmaceuticals and are positive in in vivo genotoxicity tests in liver.

여기에는 단쇄 지방족 나이트로사민, 2가 금속, 알데하이드(예: 폼알데하이드, 크로톤알데하이드), 아조 염료(예: 버터 옐로), 피롤리지딘 알칼로이드, 알릴 화합물(알릴아이소싸이오사이아네이트, 염화알릴), 나이트로(방향족, 지방족) 화합물이 포함된다.

These include short chain aliphatic nitrosamines; divalent metals; aldehydes (e.g., formaldehyde, crotonaldehyde); azo dyes (e.g., butter yellow); pyrrolizidine alkaloids; allyl compounds (allylisothiocyanate, allyl chloride), and nitro (aromatic, aliphatic) compounds.

8. 시험관내 포유류 세포 시험의 최고 농도를 1 mM으로 하는 근거는 다음과 같다. 시험조합에는 Ames 시험과 생체내 시험이 포함된다. 이 시험조합은 어느 한 시험에만 의존하지 않고 유전독성 발암물질의 검출을 최적화한다. 우려 대상 화합물(DNA 손상성 발암물질)이 Ames 시험이나 생체내 유전독성시험에서는 검출되지 않고 1 mM을 초과하는 농도의 시험관내 포유류 시험에서만 검출될 가능성은 매우 낮다. 둘째, 1 mM 한도는 조직에 농축되는 의약품을 포함하여 알려진 의약품의 임상 노출보다 높고(Goodman & Gilman, 2001), 일반적으로 생체내 비임상시험에서 도달 가능한 수준보다도 높으므로 위해요인 확인의 요소를 유지한다.

8. The rationale for a maximum concentration of 1 mM for in vitro mammalian cell assays includes the following: The test battery includes the Ames test and an in vivo assay. This battery optimizes the detection of genotoxic carcinogens without relying on any individual assay alone. There is a very low likelihood of compounds of concern (DNA damaging carcinogens) that are not detected in Ames test or in vivo genotoxicity assay, but are detectable in an in vitro mammalian assay only above 1 mM. Second, a limit of 1 mM maintains the element of hazard identification, being higher than clinical exposures to known pharmaceuticals, including those that concentrate in tissues (Goodman & Gilman, 2001), and is also higher than the levels generally achievable in preclinical studies in vivo.

일부 의약품은 치료 효과를 위해 상당히 높은 임상 노출이 필요한 것으로 알려져 있다(예: 뉴클레오사이드 유사체, 일부 항생제). 기존 의약품과의 역가 비교는 1 mM 한도를 넘는 범위에서도 의뢰자에게 관심사일 수 있으나, 사람에 대한 안전성 관련성을 결정하는 것은 궁극적으로 생체내 시험이다. 분자량이 비정상적으로 낮은(예: 200 미만) 의약품의 경우 더 높은 시험 농도를 고려하여야 한다.

Certain drugs are known to require quite high clinical exposures for therapeutic effect, e.g., nucleoside analogs and some antibiotics. While comparison of potency with existing drugs can be of interest to sponsors, perhaps even above the 1 mM limit, it is ultimately the in vivo tests that determine relevance for human safety. For pharmaceuticals with unusually low molecular weight (e.g., less than 200) higher test concentrations should be considered.

9. 일부 유전독성 발암물질은 시험 농도가 어느 정도의 세포독성을 유발하지 않는 한 시험관내 유전독성시험에서 검출되지 않지만, DNA 손상 물질은 일반적으로 중등도의 독성 수준만으로도 검출된다(Greenwood et al., 2004). 세포독성이 증가하면 화합물 또는 그 대사체에 의한 직접적인 DNA 손상 이외의 기전이 유전독성이 아닌 세포독성과 관련된 '양성' 결과를 초래할 수 있다. DNA가 아닌 표적의 손상에 따른 이러한 간접적인 DNA 손상 유발은 일정 농도 역치를 넘을 때 일어날 가능성이 더 크다. 약리학적으로 관련된 더 낮은 농도에서는 세포 과정의 교란이 일어나지 않을 것으로 예상된다.

9. Although some genotoxic carcinogens are not detectable in in vitro genotoxicity assays unless the concentrations tested induce some degree of cytotoxicity, DNA damaging agents are generally detectable with only moderate levels of toxicity (Greenwood et al., 2004). As cytotoxicity increases, mechanisms other than direct DNA damage by a compound or its metabolites can lead to ‘positive’ results that are related to cytotoxicity and not genotoxicity. Such indirect induction of DNA damage secondary to damage to non-DNA targets is more likely to occur above a certain concentration threshold. The disruption of cellular processes is not expected to occur at lower, pharmacologically relevant concentrations.

세포유전학적 시험에서는 발암물질로 알려진 약한 염색체이상 유발물질(clastogen)도 세포 수 50% 감소를 넘지 않고 양성으로 나타난다. 반면, DNA 손상성·변이원성·발암성이 없는 화합물도 독성 농도에서는 염색체 절단을 유발할 수 있다. 두 가지 시험관내 세포유전학적 시험, 즉 염색체이상시험과 시험관내 소핵시험 모두에서 약 50% 증식 감소를 한도로 하는 것이 적절한 것으로 간주된다.

In cytogenetic assays, even weak clastogens that are known to be carcinogens are positive without exceeding a 50% reduction in cell counts. On the other hand, compounds that are not DNA damaging, mutagenic or carcinogenic can induce chromosome breakage at toxic concentrations. For both in vitro cytogenetic assays, the chromosome aberration assay and the in vitro micronucleus assay, a limit of about 50% growth reduction is considered appropriate.

세포주를 이용한 세포유전학적 시험에서는, 세포 수가 독성을 과소평가할 수 있다고 알려져 있으므로 시간에 따른 세포 집단 증식의 측정(예: 집단배가(Population Doubling, PD; 주석 10)라 불리는 방법으로 대조군 대비 배양 중 세포 수 변화를 측정)이 유용한 세포독성 척도임이 입증되었다. 림프구 배양의 경우 약 50%를 넘지 않는 증식 억제로 충분한 것으로 간주되며, 이는 중기 염색체이상시험에서는 유사분열지수(Mitotic Index, MI)로, 시험관내 소핵시험에서는 세포질분열 차단에 근거한 지수로 측정할 수 있다. 또한 시험관내 소핵시험에서는 소핵을 유사분열 이후의 간기에서 계수하므로, 세포가 세포주기를 거쳐 진행하였음을 확인하는 것이 중요하다.

For cytogenetic assays in cell lines, measurement of cell population growth over time (by measuring the change in cell number during culture relative to control, e.g., by the method referred to as Population Doubling (PD; Note 10), has been shown to be a useful measure of cytotoxicity, as it is known that cell numbers can underestimate toxicity. For lymphocyte cultures, an inhibition of proliferation not exceeding about 50% is considered sufficient; this can be measured by Mitotic Index (MI) for metaphase aberration assays and by an index based on cytokinesis block for in vitro micronucleus assays. In addition, for the in vitro micronucleus assay, since micronuclei are scored in the interphase subsequent to a mitotic division, it is important to verify that cells have progressed through the cell cycle.

이는 사이토칼라신 B를 사용하여 핵분열은 일어나되 세포분열은 일어나지 않게 함으로써 이핵세포에서 소핵을 계수할 수 있게 하는 방법(림프구에 바람직한 방법)으로 할 수 있다. 세포주의 경우 위에서 기술한 시간에 따른 세포 집단 증식(PD)을 포함하여 세포 증식을 입증하는 다른 방법을 사용할 수 있다(Kirsch-Volders et al., 2003).

This can be done by use of cytochalasin B to allow nuclear division but not cell division, so that micronuclei can be scored in binucleate cells (the preferred method for lymphocytes). For cell lines, other methods to demonstrate cell proliferation, including cell population growth over time (PD) as described above, can be used (Kirsch-Volders et al., 2003).

MLA의 경우, 연한천법과 마이크로웰법 모두에서 최고 농도를 상대총증식률(Relative Total Growth, RTG) 20% 부근(10–20%)인 농도로 제한함으로써 적절한 민감도를 확보한다(Moore et al., 2002). 현행 기준을 적용하여 공개 자료를 검토한 결과, RTG 20% 미만의 농도에서만 MLA 양성이면서 설치류 발암물질인 화학물질은 매우 적었으며, 이 범주에 대해서는 유전독성 발암의 설득력 있는 증거가 없다. 합의된 견해는, 돌연변이 증가가 RTG 20% 미만에서만 관찰되는 경우 결과 해석에 신중을 기하는 것이 적절하며, 돌연변이 빈도 증가가 RTG 10%에서만 일어난 경우에는 양성 결과로 간주하지 않는다는 것이다.

For MLA, appropriate sensitivity is achieved by limiting the top concentration to one with close to 20% Relative Total Growth (RTG) (10-20%) both for soft agar and for microwell methods (Moore et al., 2002). Reviews of published data using the current criteria found very few chemicals that were positive in MLA only at concentrations with less than 20% RTG and that were rodent carcinogens, and convincing evidence of genotoxic carcinogenesis for this category is lacking. The consensus is that caution is appropriate in interpreting results when increases in mutation are seen only below 20% RTG, and a result would not be considered positive if the increase in mutant fraction occurred only at 10% RTG.

결론적으로, 증식/생존 감소가 세포유전학적 시험에서 50%, MLA에서 80%에 근접하거나 이를 초과할 때 얻어진 양성 결과는 해석에 신중을 기하는 것이 적절하다. 이러한 세포독성/클론 생존 수준에서 처리된 세포를 평가하면 민감도는 더 높아질 수 있으나 관련성 없는 양성 결과의 위험도 커진다는 점이 인정된다. 유전독성에 대한 시험조합 접근법은 높은 세포독성 조건의 단일 시험관내 포유류 세포 시험에 의존하지 않고 적절한 민감도를 보장하도록 설계되어 있다.

In conclusion, caution is appropriate in interpreting positive results obtained as reduction in growth/survival approaches or exceeds 50% for cytogenetics assays or 80% for MLA. It is acknowledged that the evaluation of cells treated at these levels of cytotoxicity/clonal survival can result in greater sensitivity but bears an increased risk of non-relevant positive results. The battery approach for genotoxicity is designed to ensure appropriate sensitivity without relying on single in vitro mammalian cell tests at high cytotoxicity.

적절한 독성 범위를 얻기 위해서는 넓은 농도 범위에 걸친 예비 용량설정시험이 유용하지만, 유전독성시험에서는 간격이 상당히 좁은(2배 미만 희석) 여러 농도를 사용하는 것이 흔히 결정적으로 중요하다. 추가 농도를 시험할 수 있으나 모든 농도에 대해 유전독성을 평가할 필요는 없다. 예를 들어 정확히 50% 증식 감소, 또는 정확히 80% RTG 감소에 도달하기 위해 여러 번 실험을 수행하라는 의도는 아니다.

To obtain an appropriate toxicity range, a preliminary range-finding assay over a broad range of concentrations is useful, but in the genotoxicity assay it is often critical to use multiple concentrations that are spaced quite closely (less than two-fold dilutions). Extra concentrations can be tested but not all concentrations need be evaluated for genotoxicity. It is not intended that multiple experiments be carried out to reach exactly 50% reduction in growth, for example, or exactly 80% reduction in RTG.

10. 세포 수는 독성을 과소평가할 수 있으므로, 시험관내 세포유전학적 시험에서는 독성 평가에 상대적 세포 증식의 척도를 사용하는 것이 적절하다(Greenwood et al., 2004). 계산된 집단배가(용어 해설 참조)를 사용하여 50% 증식 감소 수준을 추정한 결과, 변이원성이나 발암성이 없는 화합물의 양성 결과 빈도는 감소하는 반면 DNA와 직접 상호작용하여 작용하는 물질은 확실하게 양성으로 나타남이 입증되었다.

10. For in vitro cytogenetic assays it is appropriate to use a measure of relative cell growth to assess toxicity, because cell counts can underestimate toxicity (Greenwood et al., 2004). Using calculated population doublings (see Glossary) to estimate the 50% growth reduction level, it was demonstrated that the frequency of positive results with compounds that are not mutagenic or carcinogenic is reduced, while agents that act via direct interaction with DNA are reliably positive.

11. 경우에 따라 골수 중기 세포를 사용할 수 있는 것과 마찬가지로, 시험물질을 1회 이상 투여한 시험동물에서 배양한 림프구의 중기 염색체이상을 검사하는 것이 유용할 수 있다. 순환 림프구는 복제하지 않으므로, 유전독성 효과에 복제가 필요한 물질(예: 일부 뉴클레오사이드 유사체)은 이 세포 유형에서 검출되지 않을 것으로 예상된다. 일부 림프구는 비교적 수명이 길기 때문에, 원칙적으로 생체내에서 복구되지 않은 DNA 손상이 축적되어 세포가 시험관내에서 분열하도록 자극될 때 염색체이상을 일으킬 가능성이 있다. 생체내 림프구 시험은 염색체이상 유발성 징후를 후속 조사하는 데 유용할 수 있으나, 간에서는 의약품 및 대사체에 대한 노출이 흔히 더 높으므로 일반적으로 간과 같은 다른 조직이 조혈세포 소핵시험을 보완하는 데 더 많은 정보를 준다.

11. In certain cases it can be useful to examine chromosome aberrations at metaphase in lymphocytes cultured from test animals after one or more administrations of test compound, just as bone marrow metaphase cells can be used. Since circulating lymphocytes are not replicating, agents that require replication for their genotoxic effect (e.g., some nucleoside analogs) are not expected to be detected in this cell type. Because some lymphocytes are relatively long-lived, in principle there is the potential for accumulation of un-repaired DNA damage in vivo that would give rise to aberrations when the cells are stimulated to divide in vitro. The in vivo lymphocyte assay can be useful in following up indications of clastogenicity, but in general another tissue such as liver is a more informative supplement to the micronucleus assay in hematopoietic cells because exposure to drug and metabolite(s) is often higher in liver.

12. 시험조합에 두 번째 생체내 시험을 포함하는 것은 의약품 및/또는 그 대사체에 충분히 노출되는 조직을 사용하여 유전독성이 없음을 보증하기 위한 것이다. 유전독성으로 간주되는 소수의 발암물질은 간에서의 시험에서는 양성이었으나 골수에서의 생체내 세포유전학적 시험에서는 음성이었다. 이러한 예는 적절한 대사 활성이 없거나 골수의 조혈세포까지 전달되는 반응성 중간체가 없음을 반영하는 것으로 보인다.

12. The inclusion of a second in vivo assay in the battery is to provide assurance of lack of genotoxicity by use of a tissue that is well exposed to a drug and/or its metabolites; a small number of carcinogens that are considered genotoxic gave positive results in a test in liver but were negative in a cytogenetics assay in vivo in bone marrow. These examples likely reflect a lack of appropriate metabolic activity or lack of reactive intermediates delivered to the hematopoietic cells of the bone marrow.

DNA 가닥 절단, DNA 부가체, 형질전환유전자 돌연변이 시험은 여러 조직에 적용할 수 있다는 장점이 있다. 모든 생체내 시험에 대해 국제적으로 합의된 시험계획이 아직 마련되어 있지는 않으나, UDS 시험 외에도 DNA 가닥 절단 시험(Comet 시험 및 알칼리 용출 시험), DNA 부가체(공유결합) 측정, 형질전환 설치류 돌연변이 시험에 대해서는 상당한 경험과 공개 자료 및 시험계획 권고가 있다. 시험관내 MLA에서 양성이고 주로 큰 콜로니를 유발하며, 시험관내 중기 시험에서 염색체 절단을 유발하지 않는 것으로도 확인된 화합물의 경우, DNA 가닥 절단 시험보다 형질전환 마우스 돌연변이 시험 같은 생체내 돌연변이 시험을 우선 고려하여야 한다.

Assays for DNA strand breaks, DNA adducts, and mutations in transgenes have the advantage that they can be applied in many tissues. Internationally agreed protocols are not yet in place for all the in vivo assays, although considerable experience and published data and protocol recommendations exist for DNA strand break assays (Comet and alkaline elution assays), DNA adduct (covalent binding) measurements, and transgenic rodent mutation assays, in addition to the UDS assay. For a compound that is positive in vitro in the MLA and induces predominantly large colonies, and is also shown not to induce chromosome breakage in an in vitro metaphase assay, an in vivo assay for mutation, such as a transgenic mouse mutation assay, should be considered in preference to a DNA strand break assay.

UDS 시험은 주로 부피가 큰 DNA 부가체를 유발하거나 Ames 시험에서 양성인 화합물에 유용한 것으로 간주된다. 세포독성은 DNA 가닥 절단을 유발하므로, DNA 가닥 절단 시험 결과의 교란을 피하기 위해서는 세포독성을 신중하게 평가할 필요가 있다. 이는 시험관내 알칼리 용출 시험에 대해서는 잘 규명되어 있으나(Storer et al., 1996) Comet 시험에 대해서는 아직 완전히 검증되지 않았다. 원칙적으로 DNA 가닥 절단 시험은 적절한 용량 수준과 시료 채취 시점을 정하여 반복투여 독성시험에서 사용할 수 있다.

The UDS assay is considered useful mainly for compounds that induce bulky DNA adducts or are positive in the Ames test. Because cytotoxicity induces DNA strand breakage, careful cytotoxicity assessment is needed to avoid confounding the results of DNA strand break assays. This has been well characterized for the in vitro alkaline elution test (Storer et al., 1996) but not yet fully validated for the Comet assay. In principle the DNA strand break assays can be used in repeat-dose toxicology assays with appropriate dose levels and sampling times.

성숙 동물의 간은 유사분열이 활발한 조직이 아니므로 두 번째 시험에는 흔히 세포유전학적이지 않은 평가변수가 사용되지만, 부분 간절제 후나 어린 랫드(Hayashi et al., 2007)처럼 분열하는 간세포가 있을 때는 간에서의 소핵 분석이 가능하며 알려진 유전독성 화합물을 검출한다.

Since liver of mature animals is not a highly mitotic tissue, often a non-cytogenetic endpoint is used for the second assay, but when dividing hepatocytes are present, such as after partial hepatectomy, or in young rats (Hayashi et al., 2007), micronucleus analysis in liver is possible, and detects known genotoxic compounds.

13. 수성 메틸셀룰로스 같은 일반적인 부형제의 경우 대개 이것이 적절하겠으나, Tween 80 같은 부형제의 경우 투여할 수 있는 양이 급성 투여량보다 30배까지 낮을 수 있다.

13. For common vehicles like aqueous methyl cellulose this would usually be appropriate, but for vehicles such as Tween 80, the volume that can be administered could be as much as 30 fold lower than that given acutely.

14. 독성시험 설계에 노출 측정 등을 위한 추가 채혈이 포함되는 경우에는 주의가 필요하다. 채혈로 자극된 적혈구 생성은 소핵 적혈구 증가로 이어질 수 있으므로, 이러한 채혈은 소핵 분석 결과를 교란할 수 있다.

14. Caution is appropriate if the toxicological study design includes additional blood sampling, e.g., for measurement of exposure. Such bleeding could perturb the results of micronucleus analysis since erythropoiesis stimulated by bleeding can lead to increases in micronucleated erythrocytes.

15. 소핵 증가는 어떠한 유전독성 물질도 투여하지 않은 상태에서 적혈구 생성 장애(재생성 빈혈, 골수외 조혈 등), 스트레스, 저체온 및 고체온으로 인해 일어날 수 있다(Tweats et al., 2007, I에서 검토). 혈액에서는 혈액으로부터 소핵 세포의 제거에 영향을 미치는 비장 기능의 변화가 순환 소핵 적혈구의 소폭 증가로 이어질 수 있다.

15. Increases in micronuclei can occur without administration of any genotoxic agent, due to disturbance in erythropoiesis (such as regenerative anemia; extramedullary hematopoiesis), stress, and hypo- and hyperthermia (reviewed by Tweats et al., 2007, I). In blood, changes in spleen function that affect clearance of micronucleated cells from the blood could lead to small increases in circulating micronucleated red blood cells.

16. 단기 또는 반복투여 유전독성시험의 양성대조:

16. Positive controls for either short-term or repeat dose genotoxicity studies:

소핵(및 기타 세포유전학적) 시험에서 양성대조의 목적은 슬라이드를 계수하는 사람이 소핵 증가를 신뢰성 있게 검출할 수 있는지 확인하는 것이다. 이는 양성대조물질을 급성 투여한 소규모 동물군(한 성별)에 대한 주기적 시험(몇 달마다)의 시료를 사용하여 달성할 수 있다. 수동 계수의 경우 이러한 슬라이드를 각 시험에서 계수하는 코드화된 슬라이드에 포함할 수 있다. 양성대조 슬라이드는 염색 특성이나 소핵 빈도로 판독자가 알아볼 수 있어서는 안 된다. 자동 계수의 경우 각 시험마다 적절한 품질관리 시료를 사용하여야 한다.

For micronucleus (and other cytogenetic) assays, the purpose of the positive control is to verify that the individuals scoring the slides can reliably detect increases in micronuclei. This can be accomplished by use of samples from periodic studies (every few months) of small groups of animals (one sex) given acute treatment with a positive control. For manual scoring such slides can be included in coded slides scored from each study. Positive control slides should not be obvious to readers based on their staining properties or micronucleus frequency. For automated scoring, appropriate quality control samples should be used with each assay.

기타 생체내 유전독성시험에서 양성대조의 목적은 선택한 동물종, 조직 및 시험계획에서 해당 시험을 사용하여 DNA 손상/변이원성 증가를 신뢰성 있게 검출할 수 있음을 입증하는 것이다. 시험기관이 여러 독립적인 실험에서 적절한 양성대조물질을 일관되게 검출할 수 있음을 입증한 후에는, 실험 조건이 변경되지 않는다면 양성대조 실험을 주기적으로 수행하는 것으로 일반적으로 충분하다. 그러나 현재 Comet 시험에 대해서는 동시 양성대조를 두는 것이 바람직한 것으로 간주된다.

For other in vivo genotoxicity assays, the purpose of positive controls is to demonstrate reliable detection of an increase in DNA damage/mutagenicity using the assay in the chosen species, tissue and protocol. After a laboratory has demonstrated that it can consistently detect appropriate positive control compounds in multiple independent experiments, carrying out positive control experiments periodically is generally sufficient provided experimental conditions are not changed. However, currently it is considered that for the Comet assay concurrent positive controls are advisable.

17. 소핵 유발이 주로 염색체 소실에 의한 것인지 염색체 절단에 의한 것인지 판단하기 위해, 시험관내 또는 생체내에서 소핵을 염색하여 중심절이 존재하는지 확인하는 방법을 쓸 수 있다. 예를 들어 중심절 부위 DNA 서열에 대한 탐침을 사용한 형광 제자리 부합법(Fluorescent in situ Hybridization, FISH)이나 동원체 단백질에 대한 표지 항체를 사용한다. 유발된 소핵의 대다수가 중심절 양성이면 이는 염색체 소실을 시사한다. (콜히친과 빈블라스틴 같은 강력한 미세소관 독도 100% 동원체 양성 소핵을 생성하지는 않고 대개 70~80%를 생성하며, 위해성 평가에서는 주로 염색체수이상 유발물질(aneugen)로 인정된다는 점에 유의한다.)

17. Determination of whether micronucleus induction is due primarily to chromosome loss or to chromosome breakage could include staining micronuclei in vitro or in vivo to determine whether centromeres are present, e.g., using Fluorescent in situ Hybridization (FISH) with probes for DNA sequences in the centromeric region, or a labeled antibody to kinetochore proteins. If the majority of induced micronuclei are centromere positive, this suggests chromosome loss. (Note that even potent tubule poisons like colchicine and vinblastine do not produce 100% kinetochore positive micronuclei, but more typically 70 to 80%, and are accepted as primarily aneugens for assessing risk).

다른 접근법으로 시험관내 또는 생체내 중기 구조적 이상 시험을 수행할 수 있다. 음성이면 소핵 유발이 염색체 소실과 관련됨을 의미한다.

An alternative approach is to carry out an in vitro or in vivo assay for metaphase structural aberrations; if negative this would imply that micronucleus induction is related to chromosome loss.

18. 표준 유도 S9 mix는 사람 S9보다 활성화 능력이 높으며, 특정 보조인자를 공급하지 않으면 2상 해독 능력이 없다. 또한 시험관내에서는 시험 기질 농도가 높을 때 비특이적 활성화가 일어날 수 있다(Kirkland et al., 2007 참조). 사람 S9 또는 사람과 관련된 다른 활성화계를 사용한 유전독성시험이 도움이 될 수 있다. 유전독성시험 배양물의 대사체 프로파일을 분석하여 비임상 동물종(비유도 마이크로솜 또는 간세포, 또는 생체내)이나 사람 유래 조제물에서 알려진 대사체 프로파일과 비교하는 것도 시험 결과의 관련성 판단에 도움이 될 수 있으며(Ku et al., 2007), 후속 시험은 대개 간에서의 생체내 시험에 초점을 맞춘다.

18. Standard induced S9 mix has higher activation capacity than human S9, and lacks phase two detoxification capability unless specific cofactors are supplied. Also, non-specific activation can occur in vitro with high test substrate concentrations (see Kirkland et al., 2007). Genotoxicity testing with human S9 or other human-relevant activation systems can be helpful. Analysis of the metabolite profile in the genotoxicity test incubations for comparison with known metabolite profiles in preclinical species (in uninduced microsomes or hepatocytes, or in vivo) or in preparations from humans can also help determine the relevance of test results (Ku et al., 2007), and follow-up studies will usually focus on in vivo testing in liver.

S9 존재하에 시험관내에서 양성 결과를 보인 화합물이라도 대사체가 생성되지 않거나, 극소량만 생성되거나, 대사적으로 해독되거나, 빠르게 배설되기 때문에 생체내에서는 유전독성을 유발하지 않을 수 있으며, 이는 생체내 위험이 없음을 나타낸다.

A compound that gives positive results in vitro with S9 might not induce genotoxicity in vivo because the metabolite is not formed, is formed in very small quantities, or is metabolically detoxified or rapidly excreted, indicating a lack of risk in vivo.