이 문서는 진핵세포 및 원핵세포에서 재조합 DNA 단백질 제품을 생산하기 위한 발현 구조체의 특성분석에 관한 지침을 제시한다. 이 문서는 재조합 DNA 유래 단백질을 생산하는 데 사용되는 발현 구조체의 구조를 평가하는 데 유용하다고 여겨지는 정보의 유형을 기술하기 위한 것이다. 이 문서는 rDNA 유래 의약품의 품질 측면 전체를 다루기 위한 것은 아니다.

This document presents guidance regarding the characterisation of the expression construct for the production of recombinant DNA protein products in eukaryotic and prokaryotic cells. This document is intended to describe the types of information that are considered valuable in assessing the structure of the expression construct used to produce recombinant DNA derived proteins. This document is not intended to cover the whole quality aspect of rDNA derived medicinal products.

발현 구조체는 재조합 단백질의 코딩 서열을 포함하는 발현 벡터로 정의된다. 최종 제품의 품질과 일관성을 보증하기 위하여, 발현 구조체의 각 부분은 정제된 재조합 단백질에 대해 수행하는 다른 시험과 함께 핵산 기법을 사용하여 분석하여야 한다. 핵산 수준에서의 발현 구조체 분석은 품질의 전반적 평가의 일부로 고려하여야 하며, 이 시험은 재조합 유전자의 코딩 서열만을 평가할 뿐 번역 충실도나 2차 구조, 3차 구조 및 번역 후 변형과 같은 재조합 단백질의 다른 특성은 평가하지 않는다는 점을 감안하여야 한다.

The expression construct is defined as the expression vector containing the coding sequence of the recombinant protein. Segments of the expression construct should be analysed using nucleic acid techniques in conjunction with other tests performed on the purified recombinant protein for assuring the quality and consistency of the final product. Analysis of the expression construct at the nucleic acid level should be considered as part of the overall evaluation of quality, taking into account that this testing only evaluates the coding sequence of a recombinant gene and not the translational fidelity nor other characteristics of the recombinant protein, such as secondary structure, tertiary structure, and post-translational modifications.

발현 구조체를 분석하는 목적은 제품의 올바른 코딩 서열이 숙주세포에 도입되었고 배양 기간 동안 생산 종료 시점까지 유지된다는 것을 확인하는 데 있다. 살아 있는 세포에서 생산되는 재조합 단백질의 유전자 서열에는 돌연변이가 일어날 수 있으며, 이는 단백질의 성질을 변화시켜 환자에게 잠재적인 유해한 결과를 초래할 수 있다. 단일한 실험적 접근방식으로 단백질에 일어날 수 있는 모든 변형을 검출할 것으로 기대할 수는 없다. 단백질 분석 기법은 단백질의 아미노산 서열과, 단백질 분해 가공, 당쇄화, 인산화 및 아세틸화와 같은 번역 후 변형에 따른 발현 단백질의 구조적 특징을 평가하는 데 사용할 수 있다.

The purpose of analysing the expression construct is to establish that the correct coding sequence of the product has been incorporated into the host cell and is maintained during culture to the end of production. The genetic sequence of recombinant proteins produced in living cells can undergo mutations that could alter the properties of the protein with potential adverse consequences to patients. No single experimental approach can be expected to detect all possible modifications to a protein. Protein analytical techniques can be used to assess the amino acid sequence of the protein and structural features of the expressed protein due to post-translational modifications such as proteolytic processing, glycosylation, phosphorylation, and acetylation.

단백질 분석방법으로는 재조합 단백질을 코딩하는 서열의 돌연변이로 인한 단백질 구조의 모든 변화를 검출하지 못할 수 있으므로 핵산 분석 자료가 유용할 수 있다. 핵산 분석과 단백질 분석의 상대적 중요도는 제품마다 다르다.

Data from nucleic acid analysis may be useful since protein analytical methods may not detect all changes in protein structure resulting from mutations in the sequence coding for the recombinant protein. The relative importance of nucleic acid analysis and protein analysis will vary from product to product.

핵산 분석은 발현 구조체의 코딩 서열과 물리적 상태를 확인하는 데 사용할 수 있다. 핵산 분석은 발현 단백질이 올바른 아미노산 서열을 갖게 됨을 보증하기 위해 수행하는 것이며, 낮은 수준의 변이 서열을 검출하기 위한 것은 아니다. 생산 세포에 발현 구조체가 여러 사본으로 통합되어 있고 그중 일부는 전사 활성이 없을 수 있는 경우에는, 유전체 DNA를 분석하는 것보다 mRNA 또는 cDNA 분석으로 전사 산물 자체를 조사하는 것이 더 적절할 수 있다. 풀링한 클론이나 중합효소연쇄반응으로 증폭한 물질에 대해 수행하는 것과 같이 핵산의 전체 집단을 조사하는 분석적 접근방식은 개별 DNA 클론의 선별에 의존하는 접근방식의 대안으로 고려할 수 있다. 발현 구조체 내 재조합 단백질 코딩 서열을 신속하고 민감하게 확인할 수 있는 다른 기법도 고려할 수 있다.

Nucleic acid analysis can be used to verify the coding sequence and the physical state of the expression construct. The nucleic acid analysis is performed to ensure that the expressed protein will have the correct amino acid sequence but is not intended to detect low levels of variant sequences. Where the production cells have multiple integrated copies of the expression construct, not all of which may be transcriptionally active, examination of the transcription product itself by analysis of mRNA or cDNA may be more appropriate than analysis of genomic DNA. Analytical approaches that examine a bulk population of nucleic acids, such as those performed on pooled clones or material amplified by the polymerase chain reaction, may be considered as an alternative to approaches that depend on selection of individual DNA clones. Other techniques could be considered that allow for rapid and sensitive confirmation of the sequence coding for the recombinant protein in the expression construct.

다음 항에서는 생산 시스템의 개발 및 밸리데이션 과정에서 발현 구조체의 특성분석과 관련하여 제출하여야 하는 정보를 기술한다. 분석방법은 서열 확인이라는 의도한 목적에 맞게 밸리데이션하여야 한다. 밸리데이션 문서에는 최소한 변이 서열에 대한 검출한계 추정치가 포함되어야 한다. 이는 핵산 서열분석법과 단백질 서열분석법 중 어느 것에 대해서도 수행하여야 한다. 이 문서에 제시된 분석에 관한 기본 원칙과 권고사항은 새로운 기술 발전과 과학 정보를 활용할 수 있도록 주기적으로 검토하여야 한다.

The following sections describe information that should be supplied regarding the characterisation of the expression construct during the development and validation of the production system. Analytical methodologies should be validated for the intended purpose of confirmation of sequence. The validation documentation should at a minimum include estimates of the limits of detection for variant sequences. This should be performed for either nucleic acid or protein sequencing methods. The philosophy and recommendations for analysis expressed in this document should be periodically reviewed to take advantage of new advances in technology and scientific information.

제조업자는 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 기원을 기술하여야 한다. 여기에는 그 뉴클레오타이드 서열을 처음 얻은 세포의 확인 정보와 출처가 포함되어야 한다. 단백질을 코딩하는 DNA를 제조하는 데 사용한 방법을 기술하여야 한다.

The manufacturer should describe the origin of the nucleotide sequence coding for the protein. This should include identification and source of the cell from which the nucleotide sequence was originally obtained. Methods used to prepare the DNA coding for the protein should be described.

발현 구조체의 조립 단계를 상세히 기술하여야 한다. 이 기술에는 발현 구조체 구성 요소(예: 복제 기점, 항생제 내성 유전자, 프로모터, 인핸서)의 출처와 기능, 그리고 단백질이 융합 단백질로 합성되는지 여부가 포함되어야 한다. 플라스미드의 상세한 구성 요소 지도와 주석을 단 전체 서열을 제출하여야 하며, 구조체 제작 과정에서 서열을 분석한 영역과 문헌에서 가져온 영역을 구분하여 표시하여야 한다. 플라스미드가 코딩하는 다른 발현 단백질을 명시하여야 한다. 벡터에 삽입된 목적 유전자의 코딩 영역과 관련 측면 영역의 뉴클레오타이드 서열은 삽입 접합부까지 포함하여 구조체의 DNA 서열분석으로 결정하여야 한다.

The steps in the assembly of the expression construct should be described in detail. This description should include the source and function of the component parts of the expression construct, e.g., origins of replication, antibiotic resistance genes, promoters, enhancers, whether or not the protein is being synthesised as a fusion protein. A detailed component map and a complete annotated sequence of the plasmid should be given, indicating those regions that have been sequenced during the construction and those taken from the literature. Other expressed proteins encoded by the plasmid should be indicated. The nucleotide sequence of the coding region of the gene of interest and associated flanking regions that are inserted into the vector, up to and including the junctions of insertion, should be determined by DNA sequencing of the construct.

발현 구조체를 숙주세포에 도입한 방법에 관한 설명을 제출하여야 한다. 또한 발현 구조체를 증폭하는 데 사용한 방법과 생산용 세포 클론을 선별하는 데 사용한 기준을 상세히 기술하여야 한다.

A description of the method of transfer of the expression construct into the host cell should be provided. In addition, methods used to amplify the expression construct and criteria used to select the cell clone for production should be described in detail.

재조합 단백질의 생산은 잘 규정된 마스터세포은행 및 제조용세포은행을 기반으로 하여야 한다. 세포은행은 규정된 조건에서 보관되는 균일한 조성의 앰플 모음으로, 각 앰플에는 단일 세포 풀의 분주물이 들어 있다. 마스터세포은행(MCB)은 일반적으로 발현 구조체를 포함하는 선별된 세포 클론으로부터 유래한다. 제조용세포은행(WCB)은 MCB 앰플 하나 이상을 증식하여 유래한다. 세포주 이력과 세포은행의 제조 과정은 배양 중 사용한 방법과 시약, 생체외 세포연령 및 보관 조건을 포함하여 상세히 기술하여야 한다. 모든 세포은행은 관련 표현형 및 유전형 표지에 대해 특성분석을 하여야 하며, 이러한 표지에는 재조합 단백질의 발현 또는 발현 구조체의 존재가 포함될 수 있다.

Production of the recombinant protein should be based on well-defined Master and Working Cell Banks. A cell bank is a collection of ampoules of uniform composition stored under defined conditions each containing an aliquot of a single pool of cells. The Master Cell Bank (MCB) is generally derived from the selected cell clone containing the expression construct. The Working Cell Bank (WCB) is derived by expansion of one or more ampoules of the MCB. The cell line history and production of the cell banks should be described in detail, including methods and reagents used during culture, in vitro cell age, and storage conditions. All cell banks should be characterised for relevant phenotypic and genotypic markers which could include the expression of the recombinant protein or presence of the expression construct.

MCB 내 발현 구조체는 아래에 기술한 바와 같이 분석하여야 한다. MCB에 대해 시험을 수행할 수 없는 경우에는 각 WCB에 대해 수행하여야 한다.

The expression construct in the MCB should be analysed as described below. If the testing cannot be carried out on the MCB, it should be carried out on each WCB.

제한효소 지도 작성 또는 그 밖의 적절한 기법을 사용하여 발현 구조체의 사본 수, 삽입 또는 결실, 통합 부위의 수를 분석하여야 한다. 염색체외 발현 시스템의 경우, 발현 구조체를 보유하고 있는 숙주세포의 백분율을 측정하여야 한다.

Restriction endonuclease mapping or other suitable techniques should be used to analyse the expression construct for copy number, for insertions or deletions, and for the number of integration sites. For extrachromosomal expression systems, the percent of host cells retaining the expression construct should be determined.

발현 구조체의 재조합 단백질 제품에 대한 단백질 코딩 서열을 확인하여야 한다. 염색체외 발현 시스템의 경우, 발현 구조체를 분리하여 추가 클로닝 없이 제품을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 확인하여야 한다. 발현 구조체가 염색체에 사본으로 존재하는 세포의 경우, 염색체 사본을 재클로닝하고 서열분석하여 제품을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 확인할 수 있다. 또는 풀링한 cDNA 클론이나 중합효소연쇄반응으로 증폭한 물질의 서열분석과 같은 기법으로 제품을 코딩하는 핵산 서열을 확인할 수 있다. 핵산 서열은 해당 방법의 검출한계 내에서 III.A항에 기술한 바에 따라 발현 구조체에 대해 결정한 서열과 동일하여야 하며, 단백질 서열로부터 예상되는 서열과 일치하여야 한다.

The protein coding sequence for the recombinant protein product of the expression construct should be verified. For extrachromosomal expression systems, the expression construct should be isolated and the nucleotide sequence encoding the product should be verified without further cloning. For cells with chromosomal copies of the expression construct, the nucleotide sequence encoding the product could be verified by recloning and sequencing of chromosomal copies. Alternatively, the nucleic acid sequence encoding the product could be verified by techniques such as sequencing of pooled cDNA clones or material amplified by the polymerase chain reaction. The nucleic acid sequence should be identical, within the limits of detection of the methodology, to that determined for the expression construct as described in Section III.A. and should correspond to that expected for the protein sequence.

생산용 생체외 세포연령 한계는 파일럿 규모 또는 실생산 규모 조건에서 제안한 생체외 세포연령 또는 그 이상까지 증식한 생산 세포로부터 얻은 자료에 근거하여야 한다. 일반적으로 생산 세포는 제조용세포은행을 증식하여 얻으며, 적절한 타당성이 있으면 마스터세포은행을 사용하여 생산 세포를 제조할 수 있다.

The limit for in vitro cell age for production should be based on data derived from production cells expanded under pilot plant scale or full scale conditions to the proposed in vitro cell age or beyond. Generally, the production cells are obtained by expansion of the Working Cell Bank; the Master Cell Bank could be used to prepare the production cells with appropriate justification.

생산 세포의 발현 구조체는 III.B항에 기술한 MCB의 경우와 같이 1회 분석하여야 하며, 다만 생산 세포 내 발현 구조체의 단백질 코딩 서열은 핵산 시험 또는 최종 단백질 제품의 분석 중 어느 하나로 확인할 수 있다. 생산용 생체외 세포연령 한계를 높이는 경우에는 새 생체외 세포연령 한계와 같거나 그보다 큰 생체외 세포연령까지 증식한 세포의 자료로 뒷받침하여야 한다.

The expression construct of the production cells should be analysed once for the MCB as described in Section III.B., except that the protein coding sequence of the expression construct in the production cells could be verified by either nucleic acid testing or analysis of the final protein product. Increases in the defined limit for in vitro cell age for production should be supported by data from cells which have been expanded to an in vitro cell age which is equal to or greater than the new limit for in vitro cell age.

발현 구조체와 최종 정제 단백질의 특성분석은 모두 재조합 DNA 유래 제품을 일관되게 생산하는 것을 보증하는 데 중요하다. 앞에서 기술한 바와 같이, 재조합 단백질 제품의 품질을 보증하기 위해서는 핵산 분석과 최종 정제 단백질 평가 양쪽에서 얻은 분석 자료를 평가하여야 한다고 판단한다.

The characterisation of the expression construct and the final purified protein are both important to ensure the consistent production of a recombinant DNA derived product. As described above, it is considered that analytical data derived from both nucleic acid analysis and evaluation of the final purified protein should be evaluated to ensure the quality of a recombinant protein product.