이 가이드라인은 바이러스 제거(viral clearance) 및 시험을 포함하여 생명공학의약품(biotechnology product)의 바이러스 안전성 평가에 대해 기술하고, 해당 제품의 품목허가(marketing authorisation) 신청 시 제출하여야 할 자료의 개요를 제시한다. 생명공학의약품에는 사람 또는 동물(예: 포유류, 조류 또는 곤충) 유래 세포주에서 생산되는 바이오치료제 및 일부 생물의약품(biological product)이 포함된다. 이 문서에서 "바이러스"라는 용어는 포유류 프리온과 관련된 비전형적 전파성 인자(예: 소해면상뇌증(bovine spongiform encephalopathy), 스크래피(scrapie))를 제외한다.

This guideline describes the evaluation of the viral safety of biotechnology products including viral clearance and testing, and it outlines what data should be submitted in marketing applications for those products. Biotechnology products include biotherapeutics and certain biological products derived from cell lines of human or animal origin (e.g., mammalian, avian, or insect). In this document, the term virus excludes nonconventional transmissible agents like those associated with mammalian prions (e.g., bovine spongiform encephalopathy, scrapie).

전염성 해면상뇌증(transmissible spongiform encephalopathy)과 관련된 사항은 이 가이드라인의 적용 범위에 해당하지 않으므로, 신청자(applicant)는 이에 대해 관련 규제당국(regulatory authority)과 협의하는 것이 바람직하다.

Applicants are encouraged to discuss transmissible spongiform encephalopathy associated issues with the appropriate regulatory authorities as they are not in scope of this guideline.

이 가이드라인은 재조합 DNA 기술을 이용하여 시험관내(in vitro) 세포배양으로 생산되는 사이토카인, 단클론항체(monoclonal antibody, mAb), 서브유닛 백신 등의 제품을 포함한다. 또한 이 가이드라인은 제품에 부정적 영향을 미치지 않으면서 바이러스 제거를 적용할 수 있는 경우, 일부 유전자 조작 바이러스 벡터(viral vector) 및 바이러스 벡터 유래 제품(예: 바이러스 백신 및 유전자치료제(gene therapy product))도 포함한다. 이러한 제품에는 일시적 또는 안정적으로 형질감염된 세포주를 이용하거나 재조합 바이러스 감염을 통해 생산되는 바이러스 벡터, 예를 들어 아데노 부속 바이러스(adeno-associated virus, AAV)가 포함될 수 있다.

This guideline includes products such as cytokines, monoclonal antibodies (mAbs), and subunit vaccines produced from in vitro cell culture using recombinant DNA technologies. The guideline also includes certain genetically engineered viral vectors and viral vector-derived products (e.g., viral vaccines and gene therapy products), provided they are amenable to viral clearance, without a negative effect on the product. These products may include viral vectors, for example, adeno-associated virus (AAV), produced using transient or stable transfected cell lines, or by infection using a recombinant virus.

또한 바이러스 벡터 유래 제품, 예를 들어 배큘로바이러스 발현 바이러스 유사입자(virus-like particle, VLP), 단백질 서브유닛, 나노입자 기반 단백질 백신 및 치료제도 포함한다. AAV 유전자치료 벡터에는 생산 시 단순포진 바이러스(herpes simplex virus) 또는 아데노바이러스(adenovirus)와 같은 헬퍼 바이러스에 의존하는 것도 포함된다. 유전자 조작 바이러스 벡터 및 바이러스 벡터 유래 제품에 관한 구체적인 지침은 부록 6에 제시되어 있다.

It also includes viral vector-derived products, for example, baculovirus-expressed virus-like particles (VLPs), protein subunits and nanoparticle-based protein vaccines and therapeutics. AAV gene therapy vectors include those that depend on helper viruses such as herpes simplex virus or adenovirus for their production. Specific guidance on genetically engineered viral vectors and viral vector-derived products is provided in Annex 6.

불활화 바이러스 백신과 자가복제 인자를 함유한 약독화 생바이러스 백신은 이 가이드라인의 적용 범위에서 제외된다. 세포치료제는 이 가이드라인의 적용 범위에 해당하지 않으나, 해당되는 경우(예: 생물학적 출발물질 또는 원료) 이 가이드라인의 원칙을 적용할 수 있다.

Inactivated viral vaccines and live attenuated viral vaccines containing self-replicating agents are excluded from the scope of this guideline. Cell therapies are out of the scope of this guideline; however, the principles may be used as applicable (e.g., for biological starting or raw materials).

오염 위험과 더불어 동물 사용의 대체·감소·개선(replace, reduce, and refine)을 위한 전 세계적인 노력이 진행 중이므로, 생체내(in vivo)에서 복수(ascites)로 증식시킨 하이브리도마 세포로부터 물질을 제조하는 것은 더 이상 권장되지 않는다. 이러한 경우가 존재하는 때에는 생체내 시험을 차세대 염기서열 분석(Next Generation Sequencing, NGS)으로 대체하는 것을 포함하여 이 가이드라인의 원칙을 따라야 한다.

It is no longer encouraged that materials be manufactured from hybridoma cells grown in vivo as ascites due to the contamination risk as well as to the ongoing global initiative to replace, reduce, and refine the use of animals. Where this situation exists the principles of this guideline should be followed, including replacement of the in vivo assay by Next Generation Sequencing (NGS).

바이러스 오염 위험은 세포주 유래 모든 생명공학의약품에서 우려되는 사항이며, 이러한 오염은 심각한 임상적 결과를 초래할 수 있으므로 그 위험을 줄여야 한다. 이 위험은 원천 세포주 자체(세포기질(cell substrate))의 오염 또는 생산 과정 중 외래성 바이러스(adventitious virus)의 외부 유입으로 인해 발생할 수 있다. 그러나 세포주 유래 생명공학의약품이 지금까지 바이러스 전파와 관련된 사례는 없었다. 이들 제품의 바이러스 안전성은 아래에 기술한 바와 같이 포괄적인 바이러스 시험 프로그램을 적용하고 제조공정에서 달성되는 바이러스 제거(removal) 및 불활화(inactivation)를 평가함으로써 합리적으로 보증되어 왔다.

The risk of viral contamination is a concern for all biotechnology products derived from cell lines and needs to be reduced, because such contamination could have serious clinical consequences. This risk can arise from the contamination of the source cell lines themselves (cell substrates) or from exogenous introduction of adventitious virus during production. However, biotechnology products derived from cell lines have not been historically implicated in the transmission of viruses. The viral safety of these products has been reasonably assured by applying a comprehensive virus testing program and assessing virus removal and inactivation achieved by the manufacturing process, as outlined below.

생명공학의약품의 잠재적 바이러스 오염을 관리하기 위해 다음 세 가지 주요하고 상호보완적인 접근방법을 적용한다.

Three principal, complementary approaches are applied to control the potential viral contamination of biotechnology products:

유전자 조작 바이러스 벡터 및 바이러스 벡터 유래 제품의 생산 중 사용되는 일부 바이러스 제거 단계는 재조합 단백질에 사용되는 단계만큼 효과적이지 않을 수 있다. 따라서 추가적인 위험 감소를 위한 고려사항(예: 원료 처리, 광범위한 바이러스 검출을 위한 확대 시험)을 적용하여야 한다(부록 6 참조).

Some viral clearance steps used during production of genetically engineered viral vectors and viral vector-derived products may not be as effective as those used for recombinant proteins. Therefore, considerations for further risk reduction (e.g., treatment of raw materials, extensive testing for broad virus detection) should be applied (see Annex 6).

바이러스 시험에는 고유한 한계가 있다. 예를 들어, 낮은 농도의 바이러스를 검출하는 능력은 통계적 이유로 검체의 크기에 따라 달라진다. 따라서 어떠한 단일 접근방법도 제품의 바이러스 안전성을 반드시 확립한다고 할 수는 없다. 최종 제품에 감염성 바이러스가 없다는 신뢰는 많은 경우 바이러스 존재 여부에 대한 직접 시험만으로 얻어지는 것이 아니라, 정제공정이 바이러스를 제거 및/또는 불활화(제거(clearing))할 수 있음을 입증함으로써도 얻어진다.

Viral tests have inherent limitations. For example, the ability to detect low virus concentrations depends for statistical reasons on the size of the sample. Therefore, no single approach will necessarily establish the viral safety of a product. Confidence that infectious virus is absent from the final product will in many instances not be derived solely from direct testing for their presence, but also from a demonstration that the purification process is capable of removing and/or inactivating (clearing) viruses.

생산의 각 단계에서 수행하는 바이러스 시험 및 바이러스 제거 연구의 종류와 범위는 다양한 요인에 따라 달라지며, 사례별 및 단계별로 고려하여야 한다. 고려하여야 할 요인에는 세포주의 기원, 세포은행 특성분석 및 시험의 범위, 검출된 바이러스의 특성, 배지 구성성분, 배양 방법, 시설 및 설비 설계, 세포배양 후 바이러스 시험 결과, 공정의 바이러스 제거 능력, 제품의 종류 및 의도된 임상적 용도가 포함된다.

The type and extent of viral tests and viral clearance studies performed at different steps of production will depend on various factors and should be considered on a case-by-case and step-by-step basis. The factors that should be considered include the origin of the cell line, the extent of cell bank characterisation and testing; the nature of any viruses detected, culture medium constituents, culture methods; facility and equipment design; the results of viral tests after cell culture; the ability of the process to clear viruses; and the type of product and its intended clinical use.

여기에 제시된 권고사항은 특정 제품과 그 생산공정에 맞게 조정되어야 한다. 또한 바이러스 안전성을 보증하기 위해 사용한 접근방법을 설명하고 그 타당성을 제시하여야 한다. 상세 자료와 더불어 바이러스 안전성 평가의 전체 요약을 제출하여야 한다. 이 요약에는 바이러스 안전성 연구의 모든 측면과 바이러스 오염을 방지하기 위해 사용한 전략에 대한 간략한 설명이 포함되어야 한다.

The recommendations presented here should be adjusted to the specific product and its production process. Moreover, the approach used to assure viral safety should be explained and justified. In addition to the detailed data, an overall summary of the viral safety assessment should be provided. This summary should contain a brief description of all aspects of the viral safety studies and strategies used to prevent virus contamination.

생명공학의약품의 바이러스 오염은 세포주의 최초 기원으로부터, 또는 생산 세포주 확립 및/또는 세포은행 구축 과정과 생산공정 중 바이러스의 외래성 유입으로부터 발생할 수 있다. 특성분석이 잘 된 세포은행 및 바이러스 시드를 사용하면 바이러스 오염 위험을 줄일 수 있다. 마스터 바이러스 시드(master virus seed, MVS) 또는 제조용 바이러스 시드(working virus seed, WVS)로부터의 잠재적 외래성 바이러스 유입 및 관리는 부록 6에서 다룬다. 부록 6에 기술된 제품의 생산에 사용되는 바이러스(생산 바이러스)는 공정 관련 불순물(impurity)로 간주한다.

Virus contamination of biotechnology products may arise from the original source of the cell lines or from adventitious introduction of virus during generation of a production cell line and/or cell banking, and during the production process. Use of well characterised cell banks and virus seeds can reduce the risk of virus contamination. Introduction and control of potential adventitious viruses from a master virus seed (MVS) or working virus seed (WVS) are discussed in Annex 6. Viruses used for production of the products (production viruses) described in Annex 6 are considered to be process-related impurities.

외래성 바이러스 오염원은 다음과 같은 여러 경로를 통해 마스터세포은행(Master Cell Bank, MCB)에 유입될 수 있다. (1) 감염된 동물로부터의 세포주 유래, (2) 세포주 확립을 위한 바이러스 사용, (3) 오염된 생물학적 시약(예: 선별용 항체) 또는 세포배양용 원료(예: 동물 또는 사람 혈청 및 돼지 트립신)의 사용, (4) 세포 취급 및 세포은행 구축 과정 중 오염.

Adventitious virus contaminants may be introduced in the Master Cell Bank (MCB) by several routes such as (1) derivation of the cell line from an infected animal; (2) use of a virus to establish the cell line; (3) use of contaminated biological reagents (e.g., antibodies for selection) or raw materials for cell culturing (e.g., animal or human serum and porcine trypsin); or (4) contamination during cell handling and cell banking processes.

세포는 한 세포 세대에서 다음 세대로 유지되는 내재성 레트로바이러스(retrovirus)를 가지고 있다. 내재성 바이러스 서열은 항시적으로 발현되거나, 활성화되어 감염성 또는 결손 바이러스 입자를 생성할 수 있다. 세포는 또한 잠복 또는 지속 감염 바이러스(예: 헤르페스바이러스(herpesvirus))를 함유할 수 있다.

Cells have endogenous retroviruses that are maintained from one cell generation to the next. The endogenous viral sequences may be constitutively expressed or may become activated to produce infectious or defective viral particles. Cells may also contain latent or persistent viruses (e.g., herpesvirus).

외래성 바이러스는 다음을 포함하되 이에 국한되지 않는 여러 경로를 통해 생산공정을 오염시킬 수 있다. (1) 세포배양 중 동물 혈청 성분과 같은 오염된 생물학적 원료 또는 시약의 사용, (2) 생산을 위한 오염된 바이러스 시드의 사용(부록 6 참조), (3) 제품 선별 또는 정제를 위한 포유류 유래 항체 결합 친화성 레진(resin)과 같이 하류 정제 중 사용되는 오염된 원료 또는 시약의 사용, (4) 제형화 중 오염된 첨가제의 사용, (5) 비생물학적 원료의 보관 중 또는 세포배양 및 배지 취급 시 작업자에 의한 것을 포함한 환경으로부터의 오염.

Adventitious viruses may contaminate the production process by several routes including, but not limited to: (1) the use of contaminated biological raw materials or reagents such as animal serum components during cell culture; (2) the use of a contaminated virus seed for production (see Annex 6); (3) the use of a contaminated raw material or reagent used during downstream purification, such as a mammalian derived antibody-coupled affinity resin for product selection or purification; (4) the use of a contaminated excipient during formulation; and (5) contamination from the environment, including storage of non-biological raw materials or during cell culture and medium handling by personnel.

세포배양 변수(예: 세포 성장 및 생존율)의 모니터링도 잠재적 외래성 바이러스 오염의 조기 검출에 도움이 될 수 있다. 제조업자(manufacturer)는 가능한 한 제조공정에서 사람 및 동물 유래 원료(예: 사람 혈청, 소 혈청, 돼지 트립신)의 사용을 피하여야 한다. 이것이 불가능한 경우, 사람 및 동물 유래 원료의 사용은 위험에 상응하는 해당 물질의 관련 문서 또는 적격성 평가(qualification)로 뒷받침되어야 한다. 원산국, 유래 조직, 해당 물질의 제조공정 중 적용된 바이러스 불활화 또는 제거 단계, 원료에 대해 수행한 바이러스 시험의 종류와 같은 정보를 제출하여야 한다. 위해성 평가(risk assessment)에 따라 이 시험이 필요한 경우, 가능하면 불활화 이전에 수행하여야 한다.

Monitoring cell culture parameters (e.g., cell growth and viability) may also be helpful in the early detection of potential adventitious viral contamination. Manufacturers should avoid using human- and animal-derived raw materials (e.g., human serum, bovine serum, porcine trypsin) in their manufacturing processes when possible. When this is not possible, the use of human- and animal-derived raw materials should be supported by the relevant documentation or qualification of the material, commensurate with risk. Information such as the country of origin, tissue of origin, virus inactivation, or removal steps applied during the manufacturing process of the material, and the types of virus testing that have been performed on the raw material should be provided. This testing if needed according to risk assessment, should be performed before inactivation, when possible.

가능한 경우, 동물 또는 사람 혈청이나 돼지 트립신과 같이 외래성 바이러스 유입 위험이 높은 생물학적 물질은 전리방사선 조사와 같은 바이러스 불활화 처리를 하여야 한다. 추가적인 바이러스 위험 완화 전략으로는, 예를 들어 적절한 경우 바이러스 여과(virus filtration), 고온 단시간(high temperature short time) 처리, 자외선 C(ultraviolet C) 조사와 같은 세포배양 배지 또는 배지 첨가물 처리가 포함될 수 있다.

When possible, biological materials with a high risk of introducing adventitious viruses such as animal or human serum or porcine trypsin should be subjected to viral inactivation such as ionizing irradiation. Additional virus risk-mitigation strategies can include, for example, cell culture media or media supplement treatments, for example, virus filtration, high temperature short time processing, or ultraviolet C irradiation, where appropriate.

생명공학의약품의 생산에 사용할 세포주의 적격성 평가(cell line qualification)에서 중요한 부분은 바이러스 존재 여부에 대한 적절한 시험이다.

An important part of qualifying a cell line for use in the production of a biotechnology product is the appropriate testing for the presence of viruses.

표 1은 생산에 사용되는 MCB, 제조용세포은행(Working Cell Bank, WCB) 및 생체외 세포연령 한계 세포(cells at the Limit of In Vitro Cell Age, LIVCA)에 대해 1회 수행하도록 권고되는 바이러스 시험을 보여준다.

Table 1 shows the virus tests recommended to be performed once on the MCB, Working Cell Bank (WCB), and cells at the Limit of In Vitro Cell Age (LIVCA) that are used for production.

MCB에 대해서는 내재성 바이러스와 외래성 바이러스 오염 모두에 대한 광범위한 선별시험을 수행하여야 한다. 예를 들어, 하나 이상의 융합 상대가 사람 또는 사람 이외 영장류 기원인 이종 하이브리드(hetero-hybrid) 세포주의 경우, 이러한 세포에서 발생하는 바이러스 오염은 특별한 위험을 초래할 수 있으므로 사람 또는 사람 이외 영장류 기원의 바이러스를 검출하기 위한 시험을 수행하여야 한다.

Extensive screening for both endogenous viruses and adventitious viral contamination should be performed on the MCB. For hetero-hybrid cell lines, for example, in which one or more partners are human or non-human primate in origin, tests should be performed to detect viruses of human or non-human primate origin because viral contamination arising from these cells may pose a particular risk.

외래성 바이러스 시험에는 표 1에 기술된 바와 같이 광범위 바이러스 검출 시험과 특이 바이러스 검출 시험이 모두 포함되어야 한다. 광범위한 외래성 바이러스를 검출하기 위해 NGS와 같은 새로운 방법론을 도입하는 것이 권장된다. 오염 바이러스의 검출을 보장하기 위해, 시험 접근방법은 모세포주의 기원 및 이력과 생산 세포 확립 및 MCB 구축 중 사람 또는 동물 기원 물질에 대한 잠재적 노출을 고려한 위해성 평가에 근거하여야 한다. MCB가 아닌 WCB에 대해 전체 시험을 수행하는 대체 접근방법도 허용될 수 있다.

Testing for adventitious viruses should include both broad and specific virus detection assays as described in Table 1. Introduction of new methodologies such as NGS for detecting a broad range of adventitious viruses is encouraged. To ensure detection of contaminating viruses, the testing approach should be based on a risk assessment, considering the origin and history of the parental cell line and the potential exposure to materials of human or animal origin during the generation of production cells and banking of the MCB. An alternative approach in which complete testing is carried out on the WCB rather than on the MCB would also be acceptable.

각 WCB는 표 1에 기술된 바와 같이 외래성 바이러스에 대해 시험하여야 한다. 적절한 경우, MCB에 대해 외래성 바이러스 시험을 수행하였고, WCB로부터 LIVCA까지 또는 그 이상으로 배양된 세포를 얻어 외래성 바이러스 존재 여부를 시험하였다면, 해당 WCB에 대해서는 유사한 시험을 생략할 수 있다.

Each WCB should be tested for adventitious viruses as described in Table 1. When appropriate, if adventitious virus tests have been performed on the MCB, and cells cultured up to or beyond the LIVCA have been derived from the WCB and tested for the presence of adventitious viruses, then similar tests may be omitted from this WCB.

생산을 위해 설정한 LIVCA는 대표성 있는 축소 모델(scale-down model)을 이용한 소규모 조건 및/또는 파일럿 플랜트 규모 또는 상업 규모 조건에서 제안된 생체외 세포연령까지 또는 그 이상으로 확장 배양한 생산 세포로부터 얻은 자료에 근거하여야 한다. LIVCA 세포는 WCB 또는 MCB를 확장 배양하여 얻는다. LIVCA 세포는 MCB 및/또는 WCB에서 검출되지 않았을 수 있는 바이러스에 대해 1회 평가하여야 한다. 생산에 사용되는 LIVCA 세포에 대해 적합한 시험(표 1에 개략적으로 제시됨)을 1회 수행하면, 생산공정이 내재성 바이러스의 유도, 잠복 바이러스의 재활성화, 또는 저농도이거나 증식이 느린 바이러스의 증폭을 초래하지 않는다는 추가적인 보증을 얻을 수 있다.

The established LIVCA for production should be based on data derived from production cells expanded at small scale using a representative scale-down model and/or under pilot plant scale or commercial scale conditions to the proposed in vitro cell age or beyond. LIVCA cells are obtained by expansion of the WCB or the MCB. Cells at the LIVCA should be evaluated once for viruses that may have been undetected in the MCB and/or WCB. The performance of suitable tests (as outlined in Table 1) once on cells at the LIVCA used for production will provide further assurance that the production process does not lead to induction of endogenous viruses, reactivation of latent viruses or amplification of low level or slow growing viruses.

이 단계에서 외래성 바이러스가 검출되는 경우, 오염원을 확인하기 위해 MCB 및 WCB를 포함한 공정을 면밀히 점검하여야 한다. LIVCA 세포는 생산 종료 세포(End of Production Cells, EOPC)라고도 한다.

If any adventitious viruses are detected at this stage, the process, including the MCB and WCB should be checked carefully to determine the source of the contamination. Cells at the LIVCA can also be referred to as End of Production Cells (EOPC).

내재성 바이러스 및 외래성 바이러스를 검출하기 위해 여러 가지 시험법이 사용된다. 표 2에는 이러한 시험법의 예가 나열되어 있다. 이러한 시험법은 권장되는 것이지만, 이 목록이 모든 시험법을 포함하거나 확정적인 것은 아니다. 가장 적절한 기법은 과학의 발전에 따라 달라질 수 있으며, 대체 기법을 제안하는 경우 적절한 근거 자료를 함께 제출하여야 한다. 포괄적인 시험 전략은 세포주 기원, 계대 이력, 세포주 확립·세포은행 제조 및 생산에 사용된 원료 및 시약(예: 바이러스를 불활화하거나 제거할 수 있는 단계)에 대한 고려를 포함하는 철저한 바이러스 위해성 평가에 따라 수립하여야 한다. 이 전략에는 위해성 평가에 근거하여 적절한 추가 시험법을 포함하여야 한다.

A number of assays are used to detect endogenous and adventitious viruses. Table 2 lists examples of such assays. These assays are recommended, but the list is not all-inclusive nor definitive. The most appropriate techniques may change with scientific progress; proposals for alternative techniques should be accompanied by adequate supporting data. A comprehensive testing strategy should be developed following a thorough viral risk assessment that includes consideration of the cell line origin; the passage history; and the raw materials and reagents used for cell line generation, cell bank preparation, and production (e.g., steps that can inactivate or remove viruses). The strategy should include additional assays as appropriate based on risk assessment.

예를 들어, 특정 바이러스가 존재할 가능성이 상대적으로 높은 경우, 달리 타당성이 입증되지 않는 한 해당 바이러스를 검출하기 위한 특이 시험 또는 기타 접근방법을 포함하여야 한다. 적절한 시험 민감도 및 특이성을 입증하기 위해 적절한 대조군을 포함하여야 한다. 또한 해당되는 경우 잠재적 매트릭스 간섭을 고려하여야 한다.

For example, if there is a relatively high possibility of the presence of a particular virus, specific tests or other approaches for detection of that virus should be included unless otherwise justified. Appropriate controls should be included to demonstrate adequate assay sensitivity and specificity. Furthermore, potential matrix interference, where applicable should be considered.

다음은 제조업자가 제품 및 제조공정에 특이적인(또는 적절한) 포괄적 바이러스 시험 체계를 수립하는 데 사용하여야 하는 일반적인 틀에 대한 간략한 설명이다. 시험 전략에는 해당 접근방법에 대한 적절한 타당성을 함께 제시하여야 한다.

The following is a brief description of a general framework that the manufacturer should use to develop a comprehensive virus testing scheme that is specific (or appropriate) to the product and manufacturing process. The testing strategy should be accompanied with appropriate justification for the approach.

세포주는 레트로바이러스 존재 여부에 대해 특성분석을 하여야 한다. 레트로바이러스 시험은 MCB 및 생산에 사용되는 LIVCA까지 또는 그 이상으로 배양된 세포에 대해 수행하여야 한다. 이러한 시험에는 세포 상등액의 직접 접종 또는 세포의 공동배양에 의한 감염성 시험(infectivity assay), 무세포 상등액을 이용한 역전사효소(reverse transcriptase, RT) 활성 시험, 투과전자현미경(Transmission Electron Microscopy, TEM)에 의한 세포 내 입자 평가가 포함될 수 있다. TEM은 다른 인자도 검출할 수 있으므로 일반적으로 세포은행의 특성분석에 권장된다.

Cell lines should be characterised for the presence of retroviruses. Tests for retroviruses should be performed on the MCB and cells cultured up to or beyond the LIVCA used for production. These tests may include infectivity assays by direct inoculation of the cell supernatant or cocultivation of the cells, assays for reverse transcriptase (RT) activity using cell-free supernatant, and evaluation of the cells for particles by Transmission Electron Microscopy (TEM). TEM is also able to detect other agents and therefore is generally recommended for characterisation of cell banks.

세포주가 레트로바이러스 입자를 생성하는 경우(설치류, 곤충 및 조류 종에서 유래한 일부 세포주에서 나타나는 바와 같이), RT 활성이 예상되므로 PCR 기반 RT 시험(예: 제품 증폭 역전사효소(product-enhanced Reverse Transcriptase, PERT) 시험)은 필요하지 않을 수 있다. 존재하는 레트로바이러스 입자의 유형(예: A형 및 C형)을 조사하기 위해 TEM을 수행하여야 한다.

If a cell line is producing retroviral particles (as occurs in some cell lines derived from rodent, insect, and avian species), RT activity is expected and therefore a PCR-based RT assay (e.g., product-enhanced Reverse Transcriptase (PERT) assay) may not be needed. TEM should be performed to examine the type of retroviral particles (e.g., type-A and type-C) present.

내재성 레트로바이러스 입자가 감염성인지 여부를 확인하기 위해, 관련 감수성 세포(예: 일반적인 뮤린 레트로바이러스 검출용 Mus dunni, 동종지향성(ecotropic) 뮤린 레트로바이러스 검출용 SC-1 세포)와 레트로바이러스 검출을 위한 민감한 판독 시험(예: PERT 시험, 육종 양성·백혈병 음성(Sarcoma-Positive, Leukaemia-Negative, S⁺L^-) 시험, 또는 XC 플라크 시험)을 이용하여 감염성 시험을 수행하여야 한다.

To determine whether the endogenous retroviral particles are infectious, infectivity assays should be performed using relevant permissive cells (e.g., Mus dunni for general murine retrovirus detection, SC-1 cells for ecotropic murine retrovirus detection) with sensitive readout assays for retrovirus detection (e.g., PERT assay, a Sarcoma-Positive, Leukaemia-Negative (S⁺L^-) assay, or an XC plaque assay).

세포주가 레트로바이러스 입자를 생성하는지 알려지지 않은 경우, 세포에 대해 TEM을 수행하고 청징화된 상등액에 대해 RT 시험(예: PERT 시험)을 수행하여야 한다. PCR 기반 RT 시험은 레트로바이러스 RT 활성을 높은 민감도로 검출할 수 있으므로 특히 유용하나, RT 활성은 감염성 또는 비감염성 레트로바이러스와 관련될 수 있다. 일부 세포 DNA 중합효소가 RT 양성 결과를 초래할 수 있으므로, (레트로바이러스 오염으로 인한) RT 활성이 확인되거나 TEM 결과가 양성인 경우에는 사람 세포주를 포함한 감수성 세포와 레트로바이러스 검출을 위한 민감한 판독 시험을 이용하여 감염성 레트로바이러스를 검출하는 시험을 후속으로 수행하여야 한다.

If it is not known whether the cell line produces retroviral particles, TEM should be performed on cells and an RT assay (e.g., PERT assay) should be carried out on clarified supernatant. The PCR-based RT assay is particularly useful because it can detect retrovirus RT activity with high sensitivity; however, the RT activity can be associated with an infectious or non-infectious retrovirus. Because some cellular DNA polymerases can lead to a positive RT result, confirmation of the RT activity (because of a retrovirus contamination) or a positive TEM result should be followed by testing to detect infectious retroviruses in permissible cells, including human cell lines and a sensitive readout assay for retrovirus detection.

레트로바이러스 시험 결과는 이용 가능한 모든 자료를 고려하여 해석하여야 한다. 내재성 레트로바이러스 입자를 발현하는 세포주라도 3.3절 및 5절에서 논의하는 위험 평가에 근거하여 제조에 사용하는 것이 배제되지는 않는다.

Retroviral testing results should be interpreted considering all available data. Cell lines expressing endogenous retrovirus particles are not precluded from use in manufacturing based on risk evaluation as discussed in section 3.3 and section 5.

내재성 레트로바이러스에 대해 특성분석이 잘 된 세포주(예: 차이니즈 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary, CHO), NS0, Sp2/0 및 Vero, 또는 사전 지식(prior knowledge)에 근거한 기타 세포주)에 대해서는 화학적 유도 연구를 수행할 필요가 없다. 그러나 이러한 연구는 새로운 세포기질에 미지의 유도성 내재성 레트로바이러스가 존재하는지 평가하는 데 도움이 될 수 있다. 또한 위해성 평가에 근거하여 잠복 DNA 바이러스(예: 사람 세포의 헤르페스바이러스) 및 잠복 RNA 바이러스(예: 곤충 세포의 노다바이러스(nodavirus))에 대한 유도 연구도 적절할 수 있다. 이러한 연구는 새로운 세포기질 유래 제품에 대한 바이러스 시험 및 제거 전략 수립에 도움이 될 수 있다.

Chemical induction studies need not be performed for cell lines that have been well characterised for endogenous retroviruses (e.g., Chinese Hamster Ovary (CHO), NS0, Sp2/0 and Vero or other cell lines based on prior knowledge). However, such studies may help to evaluate a new cell substrate for the presence of an unknown inducible endogenous retrovirus. Furthermore, induction studies for latent DNA viruses (e.g., herpesvirus in human cells) and latent RNA viruses (e.g., nodavirus in insect cells) may also be appropriate based on risk assessment. These studies may help inform the virus testing and clearance strategy for products derived from a new cell substrate.

시험관내 시험(in vitro assay)은 다양한 사람 및 관련 동물 바이러스를 검출할 수 있는 여러 지시세포 배양에 시험물질(표 2 참조)을 접종하여 수행한다. 지시세포주 패널에는 기원 종의 세포주, 사람 이배체 세포(예: MRC-5) 및 원숭이 신장 세포주(예: Vero)가 포함되어야 한다. 추가 세포주를 포함할 수 있다. 시험에 사용하는 세포의 선택은 시험 대상 세포기질의 기원 종을 고려한 위해성 평가에 근거하여야 한다.

In vitro assays are carried out by inoculating a test article (see Table 2) on to various indicator cell cultures capable of detecting a wide range of human and relevant animal viruses. The panel of indicator cell lines should include a cell line of the species of origin, human diploid cells (e.g., MRC-5) and a monkey kidney cell line (e.g., Vero). Additional cell lines may be included. The choice of cells used in the test should be based on a risk assessment considering the species of origin of the cell substrate to be tested.

감염성 시험의 특성 및 시험할 검체는 세포의 기원 또는 취급에 근거하여 존재할 수 있는 바이러스의 유형에 따라 결정된다. 지시세포 배양은 기존 지역 규정 및 지침에 부합하도록 세포변성 바이러스, 혈구흡착 바이러스 및 혈구응집 바이러스에 대해 모니터링하여야 한다. MCB, WCB 및 LIVCA의 적격성 평가를 위해서는 감수성 세포에서 2주차에 최소 1회의 계대배양을 포함하여 28일간 시험을 수행하여야 한다.

The nature of the infectivity assay and the sample to be tested are governed by the type of virus that may be present based on the origin or handling of the cells. The indicator cell cultures should be monitored for cytopathic viruses, hemadsorbing and hemagglutinating viruses, consistent with existing regional regulations and guidance. For qualification of the MCB, WCB, and LIVCA, 28-day testing on permissive cells should be performed with at least one sub-passage at two weeks.

NGS 또는 기타 분자생물학적 방법을 사용하여 이 시험을 보완하거나 대체할 수 있다. 이를 통해 시험관내 세포배양 감염성 시험의 일반적인 한계(예: 세포주의 감염 감수성) 및 생산 시스템의 특정 한계(예: 시험물질에 의한 간섭 또는 독성)를 해결할 수 있다.

NGS or other molecular methods may be used to supplement or replace the assay. This could address general limitations of the in vitro cell culture infectivity assay (e.g., susceptibility of cell lines to infection) and specific limitations of the production system (e.g., test article-mediated interference or toxicity).

생체내 시험은 세포은행의 이력 및 제조와 시험 전략을 고려한 위해성 평가에 근거하여 수행할 수 있다. 그러나 CHO, NS0 및 SP2/0과 같이 광범위하게 사용되고 특성분석이 잘 된 세포주에 대해서는 사전 지식에 근거하여 생체내 시험이 필요하지 않다. 위험 기반 고려사항에는 형질감염되지 않은 모세포주에 대해 이전에 수행한 생체내 바이러스 시험 또는 NGS 시험, 그리고 모세포은행으로부터 MCB 유래 과정의 관리가 포함된다. MCB 확립에 사용한 방법을 포함하여, 동일한 모세포은행에서 유래한 다른 MCB의 바이러스 안전성 시험에 관한 사전 지식도 고려하여야 한다. WCB가 승인된 관리 조건에서 제조된 경우, WCB에 대해서는 일반적으로 이 시험이 필요하지 않다.

In vivo testing may be performed based on risk assessment considering the history and manufacturing of the cell bank and the testing strategy. However, in vivo testing is not necessary for extensively used well-characterised cell lines such as CHO, NS0 and SP2/0, based on prior knowledge. Risk-based considerations include prior in vivo virus testing or NGS testing of the parental untransfected cell line and control of the derivation of the MCB from the parental cell bank. Prior knowledge of viral safety testing of other MCB derived from the same parental cell bank including the method used to establish the MCB also should be considered. The test is generally not necessary for the WCB if it is prepared under approved controlled conditions.

LIVCA 세포의 경우, 사전 지식 및 기타 위험 기반 고려사항에 근거하여 이 시험이 필요하지 않을 수 있다.

For cells at the LIVCA, the test may not be necessary based on prior knowledge and other risk-based considerations.

잔류 위험이 남아 있는 경우, MCB 확립 중 또는 LIVCA 단계까지의 세포배양 중 유입되었을 수 있는 바이러스를 검출하기 위해 이 시험을 유지하거나 비표적(non-targeted) NGS로 대체하는 것을 고려할 수 있다.

If residual risk remains, retention of the test or replacement with non-targeted NGS can be considered to detect viruses that may have been introduced during establishment of the MCB or during culture of the cells to the LIVCA stage.

생체내 시험은 젖먹이 마우스, 성체 마우스 및 발육란에 시험물질(표 2 참조)을 접종하는 것을 포함할 수 있다. 동물의 건강 상태를 모니터링하여야 하며, 이상이 있는 경우 원인을 규명하기 위해 조사하여야 한다.

The use of the in vivo assay may include inoculation of test article (see Table 2) into suckling mice, adult mice, and embryonated hen’s eggs. The health of the animals should be monitored, and any abnormality should be investigated to establish the cause.

바이러스 검출의 폭과 민감도 및 생체내 시험의 한계로 인해, 생체내 시험의 대체 방법으로 비표적 NGS가 권장된다. 또한 이는 동물시험 사용의 대체·감소·개선을 위한 전 세계적인 노력을 촉진한다.

Non-targeted NGS is encouraged as a replacement for in vivo assays due to its breadth and sensitivity of virus detection and the limitations of the in vivo assays. Furthermore, this promotes the global initiative to replace, reduce, and refine the use of animal testing.

시험 대상 특이 바이러스 목록은 바이러스 오염 위해성 평가에 근거하여 정하며, 세포의 기원 및 바이러스 오염의 잠재적 원인(예: 생물학적 원료, 특히 사람 또는 동물 기원 원료)을 고려한다(이에 국한되지 않음). 사람 또는 동물 유래 원료(예: 소 혈청 및 돼지 트립신)에 노출된 세포주의 경우, 사람, 소 및 돼지 바이러스에 대한 시험을 수행하여야 한다.

The list of specific viruses to be tested for is defined based on a viral contamination risk assessment and considers (but is not limited to) the origin of the cells and the potential sources of viral contamination (e.g., biological raw materials, especially those of human or animal origin). For cell lines with exposure to human or animal derived raw materials, (e.g., bovine serum and porcine trypsin), tests for human, bovine and porcine viruses should be performed.

설치류 기원 세포주 또는 설치류 물질에 노출된 세포주의 경우, 종 특이적 바이러스를 검출하기 위해 핵산증폭시험(Nucleic Acid Amplification techniques, NAT) 또는 마우스, 랫드 또는 햄스터를 이용한 항체 생성 시험을 사용한다. 이러한 시험은 특정 동물 종의 바이러스에 노출될 가능성이 있는 경우 수행하여야 한다. 예를 들어, 설치류 기원 세포주, 설치류를 통한 계대로 확립된 세포주, 설치류 물질에서 유래했을 수 있는 시약을 사용한 경우의 설치류 바이러스 존재 여부는 마우스, 랫드, 햄스터와 같은 특정 병원체 부재(specific pathogen free) 동물에 시험물질(표 2 참조)을 접종한 후 해당 동물에서 특정 인자에 대한 항체를 시험하여 검출할 수 있다.

For cell lines of rodent origin or exposure to rodent materials, Nucleic Acid Amplification techniques (NAT) or antibody production tests in mice, rats or hamsters are used to detect species-specific viruses. These tests should be performed when the potential exists for exposure to viruses of a specific animal species. For example, the presence of rodent viruses in cell lines of rodent origin, or cell lines generated by passage through rodents and the use of reagents that may have been derived from rodent materials, can be detected by inoculation of the test article (see Table 2) into specific pathogen free animals, such as mice, rats, and hamsters, that are subsequently tested for antibodies to specific agents.

이러한 시험의 예로는 마우스 항체 생성(Mouse Antibody Production, MAP) 시험, 랫드 항체 생성(Rat Antibody Production, RAP) 시험, 햄스터 항체 생성(Hamster Antibody Production, HAP) 시험이 있다. 현재 항체 생성 시험에서 선별 대상인 바이러스는 표 3에서 다룬다.

Examples of such tests are the Mouse Antibody Production (MAP) test, Rat Antibody Production (RAP) test, and Hamster Antibody Production (HAP) test. The viruses currently screened for in the antibody production assays are discussed in Table 3.

PCR 시험과 같은 NAT, 표적 또는 비표적 NGS, 또는 기타 분자생물학적 방법은 직접 비교시험(head-to-head comparison) 없이 표 3에 기술된 동물 시험을 대체하는 데 사용할 수 있다.

NAT such as PCR assays or targeted or non-targeted NGS or other molecular methods can be used for replacing the animal assays described in Table 3, without head-to-head comparison.

NAT 및 NGS와 같은 분자생물학적 방법은 바이러스 검출에 사용된다. NGS는 기지(known) 및 신규 바이러스의 광범위한(비표적) 검출에 적절할 수 있다. NGS는 염기서열 분석 전략 또는 생물정보학적 분석을 통해 바이러스의 표적 검출에도 사용할 수 있다. 비표적 NGS는 의도한 목적에 적합함이 입증되는 한, 직접 비교시험 없이 생체내 시험을 대체하고 시험관내 세포배양 시험을 보완하거나 대체하는 데 사용할 수 있다. 시험 체계 간 종말점이 다르고, 기지 및 미지 바이러스를 광범위하게 검출할 수 있는 NGS의 향상된 능력에 비해 시험관내 및 생체내 방법은 바이러스 검출 범위에 한계가 있으므로, 직접 비교시험은 권장되지 않는다.

Molecular methods such as NAT and NGS are used for virus detection. NGS may be appropriate for broad (non-targeted) detection of known and novel viruses. NGS can also be used for targeted detection of viruses by the sequencing strategy or by bioinformatic analysis. Non-targeted NGS can be used to replace the in vivo assays and supplement or replace the in vitro cell culture assays, without a head-to-head comparison as long as the method is demonstrated to be suitable for its intended purpose. A head-to-head comparison is not recommended due to the different end points of the assay systems and limitations of the breadth of virus detection by the in vitro and in vivo methods compared to the enhanced capability of NGS for broad virus detection of known and unknown viruses.

시험관내 및 생체내 시험의 결과는 특정 표적 시스템에서의 검출을 위해 바이러스 복제 및 생물학적 특성에 의존하므로 검출 범위가 제한된다. 생체내 시험을 NGS로 대체하는 것은 시험용 동물 사용의 대체·감소·개선이라는 전 세계적인 목표의 취지에도 부합한다.

The results of the in vitro and in vivo assays rely on virus replication and biological properties for detection in the specific target system which limits the breadth of detection. Replacement of in vivo assays by NGS also meets the intent of the global objective to replace, reduce, and refine the use of animals for testing.

PCR 기반 방법과 같은 NAT는 바이러스 특이적 검출에 사용할 수 있다. 표적 또는 비표적 NGS는 직접 비교시험 없이 바이러스 특이적 검출을 위한 다수의 PCR 시험을 대체하는 데 사용할 수 있다. 이는 바이러스 변이체 검출의 한계를 극복하는 데에도 도움이 될 수 있다. 양성 결과는 검출된 핵산이 감염성 바이러스와 관련되어 있는지 확인하기 위해 조사하여야 한다.

NATs such as PCR-based methods may be used for virus specific detection. Targeted or non-targeted NGS can be used to replace the large number of PCR assays for virus specific detection without a head-to-head comparison. This can also help overcome the limitation of detection of virus variants. Positive results should be investigated to determine whether detected nucleic acids are associated with an infectious virus.

PCR 기반 방법과 같은 NAT는 일반적으로 단일 또는 다중(multiplex) 형식으로 사용되어 기지 바이러스 또는 기지의 밀접하게 관련된 바이러스 과(family)의 바이러스 서열을 검출한다. 이러한 분자생물학적 방법은 시험 간섭으로 인한 한계가 있을 때 세포배양 시험을 보완하는 데 사용할 수 있으며, 감염성 시험으로 검출할 수 있을 만큼 세포배양에서 쉽게 증식시킬 수 없는 바이러스의 특이적 검출에 효과적인 도구이다. NAT는 더 넓은 범위의 바이러스 검출에 맞게 변형할 수도 있으나(예: 축퇴 PCR(degenerate PCR)), 특이성이 감소할 수 있다. 시험의 특이성 때문에, 하나의 보다 일반적인 생물학적 시험으로 검출될 더 넓은 범위의 바이러스를 검출하기 위해 여러 개의 바이러스 특이적 PCR 시험을 사용할 수 있다.

NATs such as PCR-based methods are typically used singly or in a multiplex format to detect viral sequences from known viruses or known closely related virus families. These molecular methods can be used to supplement cell culture assays when there are limitations because of assay interference, and they are effective tools for specific virus detection when such viruses cannot be readily grown in cell culture for detection by infectivity assays. NAT also have the capacity to be adapted for broader range virus detection (e.g., degenerate PCR), but specificity may be reduced. Because of the assay specificity, multiple virus-specific PCR assays may be used to detect a broader range of viruses that would be detected by a single more general biological assay.

NAT는 의도한 용도에 대해 적절히 밸리데이션(validation)하여야 한다. 여기에는 해당되는 경우 시험방법 밸리데이션 및 매트릭스 특이적 확인(verification)이 포함된다.

NAT should be appropriately validated for their intended use. This includes the method validation and matrix-specific verification, as applicable.

NGS(고처리량 염기서열 분석(high-throughput sequencing)이라고도 함)는 광범위한 바이러스 검출 능력이 입증된 방법으로 이용 가능하다. NGS는 정의된 민감도와 바이러스 검출 범위를 제공할 수 있으며, 동물 사용과 시험 기간을 줄일 수 있다. 비표적 NGS는 직접 비교시험 없이, 미지 또는 예상치 못한 바이러스 종에 대한 광범위한 바이러스 검출로 생체내 시험을 대체할 수 있다.

NGS (also known as high-throughput sequencing) is available with demonstrated capabilities for broad virus detection. NGS can provide defined sensitivity and breadth of virus detection and can reduce animal use and testing time. Non-targeted NGS can replace the in vivo tests with broad virus detection for unknown or unexpected virus species without a head-to-head comparison.

비표적 NGS는 또한 직접 비교시험 없이 기지, 미지 또는 예상치 못한 바이러스의 검출을 위해 시험관내 세포배양 시험을 보완하거나 대체하는 데 사용할 수 있다. 이를 통해 시험관내 세포배양 감염성 시험의 일반적인 한계(예: 세포주의 감염 감수성) 및 생산 시스템의 특정 한계(예: 시험물질에 의한 간섭 또는 독성)를 해결할 수 있다.

Non-targeted NGS may also be used without a head-to-head comparison to supplement or replace the in vitro cell culture assays for detection of known and unknown or unexpected viruses. This could address general limitations of the in vitro cell culture infectivity assay (e.g., susceptibility of cell lines to infection) and specific limitations of the production system (e.g., test article-mediated interference or toxicity).

NGS는 염기서열 정보가 확보된 기지 바이러스의 표적 검출에 사용할 수 있다. 또는 NGS 생물정보학적 분석을 특정 바이러스 검출에 맞추어 표적화할 수 있다.

NGS can be used for targeted detection of known viruses based upon availability of their sequence information. Alternatively, the NGS bioinformatic analysis can be targeted for detection of specific viruses.

NGS(표적 또는 비표적)는 직접 비교시험 없이 바이러스 특이적 PCR 시험 및 설치류 항체 생성 시험(3.2.4절)을 대체할 수 있다. 생체내 시험을 NGS로 대체하는 것은 시험용 동물 사용의 대체·감소·개선이라는 전 세계적인 목표의 취지에도 부합한다.

NGS (targeted or non-targeted) can replace virus-specific PCR assays and rodent antibody production tests (Section 3.2.4) without a head-to-head comparison. Replacement of in vivo assays by NGS also meets the intent of the global objective to replace, reduce, and refine the use of animals for testing.

NGS는 세포주의 특성분석 또는 세포은행, 바이러스 시드나 미정제 원액(unprocessed bulk) 수확물의 시험에 사용하는 것을 고려할 수 있다. 이는 바이러스 벡터의 효과적인 중화가 이루어지지 않아 시험 간섭이 발생하는 경우(부록 6 참조) 또는 제품이나 배지 성분에 의한 독성이 있는 경우에 특히 유용할 수 있다. 이러한 용도에서 NGS는 모든 유전체 바이러스 핵산(유전체학(genomics)), 바이러스 mRNA(전사체학(transcriptomics)), 또는 캡시드에 싸인 바이러스 유전체(바이롬학(viromics))를 분석하는 데 적용할 수 있다. 세포배양 유래 물질을 분석하는 경우, 유전체학 및 전사체학에는 세포에서 제조한 핵산을 사용하고, 바이롬학에는 세포배양 상등액 또는 무세포 바이러스 제제를 사용한다.

Use of NGS can be considered for characterisation of the cell line or testing of the cell bank, virus seed or unprocessed bulk harvest. This can be particularly useful in case of assay interference as a result of lack of effective neutralization of the viral vector (see Annex 6) or toxicity caused by the product or media components. In such applications, NGS can be applied to analyse all genomic viral nucleic acids (genomics), viral mRNAs (transcriptomics), or encapsidated viral genomes (viromics). When analysing cell culture-derived materials, nucleic acids prepared from cells are used for genomics and transcriptomics while cell culture supernatants or cell free virus preparations are used for the viromics.

이러한 서로 다른 전략을 선택한 근거를 제시하여야 한다.

The rationale for selecting these different strategies should be provided.

기지 및 신규 바이러스를 민감하고 광범위하게 검출하기 위해 NGS를 적용하는 경우, NGS 작업 흐름에서 고려하여야 할 몇 가지 핵심 단계가 있다. (1) 검체 물질의 유형에 따라 바이러스 검출을 극대화하기 위해 필요할 수 있는 검체 전처리(수행하는 경우) 및 바이러스 농축 단계, (2) 바이러스 핵산 추출(외피 보유 및 비외피 입자로부터)과 라이브러리 제조(DNA 및 RNA 바이러스)의 효율, (3) 민감한 바이러스 검출을 위한 적합한 염기서열 분석 플랫폼의 선택, (4) 광범위한 바이러스 검출 전략을 이용하여 다양한 바이러스 과의 바이러스 서열이 폭넓게 수록된 데이터베이스에 대해 수행하는 생물정보학적 분석. 데이터베이스에 존재할 수 있는 비바이러스 서열과 구별하기 위해, 바이러스 특이적 신호의 검출을 확인하는 후속 전략이 필요할 수 있다.

When applying NGS for sensitive and broad detection of known and novel viruses, there are several critical steps in the NGS workflow for consideration: (1) sample pre-treatment (when performed) and virus enrichment steps that may be needed to maximise virus detection based on the type of sample material; (2) efficiency of viral nucleic acid extraction (from enveloped and nonenveloped particles) and library preparation (DNA and RNA viruses); (3) selection of a suitable sequencing platform for sensitive virus detection; and (4) bioinformatics analysis against a database with diverse representation of viral sequences of different viral families using strategies for broad virus detection. A follow up strategy may be needed to confirm the detection of a virus specific signal to distinguish from non-viral sequences that could be present in the database.

작업 흐름에 포함된 여러 단계의 성능을 평가하고 바이러스 검출의 민감도, 특이성 및 범위를 입증하기 위해, 시험방법 적격성 평가 및 밸리데이션에 적합한 표준물질을 사용하여야 한다. 여기에는 물리적 특성(크기, 외피 보유 및 비외피), 화학적 특성(낮은, 중간 및 높은 저항성), 유전체 특성(DNA, RNA, 이중가닥 및 단일가닥, 선형, 원형)이 서로 다른 바이러스를 포함하는 현재 이용 가능한 표준 바이러스 시약/패널을 사용하여 전체 NGS 작업 흐름 또는 특정 단계의 성능을 평가하는 것이 포함될 수 있다. 광범위한 바이러스 검출을 위해 다양한 바이러스 서열을 포함하는 포괄적인 바이러스 데이터베이스를 사용하여야 한다. 특정 기술적 단계 및 생물정보학적 단계를 평가하기 위해 다른 유형의 표준물질을 사용할 수 있다.

Suitable reference materials should be used for method qualification and validation to evaluate performance of the different steps involved in the workflow and to demonstrate sensitivity, specificity, and breadth of virus detection. This can include using currently available reference virus reagents/panels which contain viruses of distinct physical (size, enveloped and non-enveloped), chemical (low, medium, and high resistance), and genomic (DNA, RNA, double- and single-stranded, linear, circular) characteristics to evaluate the performance of the entire NGS workflow or specific steps. A comprehensive viral database should be used with diverse viral sequences for broad virus detection. Other types of reference materials may be used to evaluate the specific technical and bioinformatic steps.

사용하는 모든 NGS 방법에 대해, 해당 적용의 의도한 용도를 뒷받침하는 밸리데이션/적격성 평가 자료를 제출하여야 한다. 대체 방법으로 사용하는 경우, 여기에는 시험방법 밸리데이션 및 매트릭스 특이적 확인이 포함된다. 보완 방법으로 사용하는 경우, 여기에는 시험방법 적격성 평가 및 매트릭스 특이적 확인이 포함된다. 시험방법 밸리데이션은 사전에 정한 성능 기준을 필요로 하는 반면, 시험방법 적격성 평가는 시험방법의 성능 특성만을 평가한다. NGS는 한도시험으로 사용되므로, 시험방법 밸리데이션/적격성 평가를 위한 성능 특성(특이성/검출 범위 및 민감도)은 ICH Q2의 원칙을 고려하여야 한다.

For any NGS method used, validation/qualification should be provided to support its intended use for the application. This includes method validation and matrix-specific verification when used as a replacement method. When used as a supplementary method, this includes method qualification and matrix-specific verification. Method validation requires predefined performance criteria while method qualification only evaluates the performance characteristics of the method. NGS is used as a limit test and as such, the performance characteristics (specificity/breadth of detection and sensitivity) for method validation/qualification should consider the principles of ICH Q2.

제품 제조에 사용되는 일부 세포주는 내재성 레트로바이러스, 기타 바이러스, 또는 감염성 바이러스로 재활성화될 수 있는 바이러스 서열을 함유하고 있을 것이다. 이러한 경우 제조에 권고되는 조치 계획은 5절에 기술되어 있다. 내재성 레트로바이러스 이외의 바이러스를 함유한 세포주의 허용 가능성은 제품의 유익성 및 의도된 임상적 용도, 오염 바이러스의 특성, 해당 바이러스의 사람 감염 또는 사람 질병 유발 가능성, 제품의 정제공정(예: 바이러스 제거 평가 자료), 정제 원액에 대해 수행한 바이러스 시험의 범위에 근거한 위해성-유익성 분석을 고려하여 관련 규제당국이 개별적으로 검토한다.

Some cell lines used to manufacture a product will contain endogenous retroviruses, other viruses, or viral sequences that may become reactivated as infectious viruses. In such circumstances, the action plan recommended for manufacture is described in Section 5. The acceptability of cell lines containing viruses other than endogenous retroviruses will be considered on an individual basis by the appropriate regulatory authorities, considering a risk-benefit analysis based on the benefit of the product and its intended clinical use, the nature of the contaminating viruses, their potential for infecting humans or for causing disease in humans, the purification process for the product (e.g., viral clearance evaluation data), and the extent of the virus tests conducted on the purified bulk.

제조업자는 생산 배치(batch)에 대해 외래성 바이러스를 정기적으로 시험하는 프로그램을 수립하는 것이 권장된다. 미정제 원액에 대한 바이러스 시험의 범위는 목적 제품의 생산에 사용되는 세포주의 특성, 세포주 적격성 평가 중 수행한 바이러스 시험의 결과 및 범위, 배양 방법, 원료 및 시약의 출처, 바이러스 제거 연구 결과를 포함한 여러 사항을 고려하여야 한다. 유전자 조작 바이러스 벡터 및 바이러스 벡터 유래 제품의 미정제 원액 시험에 대해서는 부록 6을 참조한다.

It is recommended that manufacturers develop programs to routinely test for adventitious viruses in production batches. The extent of virus testing on the unprocessed bulk should consider several points including the nature of the cell lines used to produce the desired products, the results and extent of virus tests performed during the qualification of the cell lines, the cultivation method, the raw material and reagent sources, and the results of viral clearance studies. See Annex 6 for testing of unprocessed bulk for genetically-engineered viral vectors and viral vector-derived products.

배치 공정의 경우, 미정제 원액은 세포와 배양 배지의 단일 수확물 또는 여러 수확물을 합한 것으로 구성된다. 세포배양으로부터 제품을 연속 수확하는 공정의 경우, 흐름에서 채취한 합쳐진 중간체 또는 미정제 원액 검체가 있을 수 있다. 추가 공정 이전에 생산 반응기에서 꺼낸 미정제 원액의 대표 검체는 외래성 바이러스 오염 가능성을 높은 검출 확률로 판정할 수 있는 가장 적합한 단계 중 하나에 해당한다. 따라서 미정제 원액에 대해 적절한 바이러스 시험을 수행하여야 한다. 생물반응기 내 세포 관련 바이러스 검출에 대한 세포 분리 기술의 잠재적 영향을 고려하여야 한다. 미정제 원액이 독성을 나타내거나 세포배양 시험에서 바이러스 검출에 간섭을 일으키는 경우, 최소한의 검체 희석 또는 대체 시험(예: NGS)을 고려할 수 있다(3.2절 참조).

For batch processing, the unprocessed bulk constitutes one or multiple pooled harvests of cells and culture media. For processes that involve a continuous product harvest from cell culture, there may be pooled intermediate or unprocessed bulk sample(s) collected from a flow stream. A representative sample of the unprocessed bulk, removed from the production reactor before further processing, represents one of the most suitable levels at which the possibility of adventitious virus contamination can be determined with a high probability of detection. Therefore, appropriate testing for viruses should be performed on the unprocessed bulk. The potential impact of cell separation technology on detecting cell-associated virus in the bioreactor should be considered. If unprocessed bulk is toxic or causes interference with virus detection in cell culture assays, minimal sample dilution or alternative testing (e.g., NGS) can be considered (see Section 3.2).

세포 관련 바이러스를 검출하기 위해서는 생산 반응기에서 꺼낸 온전한 세포와 세포 용해물(파쇄된 세포 및 세포배양 상등액)의 혼합물을 시험하여야 한다. 관류 배양 또는 연속 제조(continuous manufacturing, CM) 공정의 경우, (예: 중공사(hollow fibre) 또는 이와 유사한 정밀여과 시스템의 사용으로 인해) 세포에 쉽게 접근하지 못할 수 있다. 이러한 경우에는 세포배양에서 얻은 무세포 제품 수확물을 사용할 수 있다. 세포배양으로부터 제품을 연속 수확하는 공정의 경우, 외래성 바이러스 및 내재성 바이러스 입자의 수준이 세포배양 기간에 따라 달라질 수 있으므로 검체 채취 전략(검체의 채취 주기 및 구성 포함)의 타당성을 제시하여야 한다(7절 참조).

In order to detect cell-associated virus a mixture of both intact cells and cell lysates (disrupted cells and cell culture supernatants) that are removed from the production reactor should be tested. For perfusion or continuous manufacturing (CM) processes, cells may not be readily accessible (e.g., because of the use of hollow fibre or similar microfiltration systems). In such cases, cell-free product harvest from cell culture can be used. For processes that involve continuous product harvest from cell culture, the sampling strategy (including periodicity and composition of the samples) should be justified because the level of adventitious viruses and endogenous virus particles may vary along the cell culture duration (see Section 7).

외래성 바이러스 시험은 각 미정제 원액에 대해 정기적으로 적용하여야 한다. 이 시험에는 여러 지시세포주를 이용한 시험관내 시험 또는 비표적 NGS가 포함될 수 있다(3.2절 참조). 지시세포 배양은 2주차에 최소 1회의 계대배양을 포함하여 28일간 관찰하여야 한다. 위해성 평가(세포기질, 생산을 위한 배양 기간, 동물 유래 원료 또는 시약의 사용, 공정의 바이러스 제거 수준 고려)에 근거하여, 타당성이 있는 경우 세포주에 대한 시험 기간을 14일로 단축할 수 있다. 또한 오염원의 잠재적 유입에 대한 위해성 평가에 근거하여, 특정 바이러스(예: 생쥐 미세 바이러스(minute virus of mice, MVM)) 또는 바이러스 과의 검출을 위해 NAT 또는 표적 NGS와 같은 방법도 적절할 수 있다.

Adventitious virus testing should be routinely applied to each unprocessed bulk. This testing may include in vitro assays using several indicator cell lines or non-targeted NGS (see Section 3.2). The indicator cell cultures should be observed for 28 days including at least one sub-passage at two weeks. Assay duration may be reduced with justification to 14 days for cell lines based on a risk assessment (considering the cell substrate, cultivation period for production, use of animal-derived raw materials or reagents, and level of viral clearance of the process). Additionally, methods, such as NAT or targeted NGS, may also be appropriate for detection of specific viruses (e.g., minute virus of mice) or virus families, based on risk assessment for potential introduction of contaminants.

이러한 신속 시험법은 실시간 의사결정을 용이하게 할 수 있다.

Such rapid test methods can facilitate real-time decision making.

미정제 원액 단계에서 외래성 바이러스가 검출되는 경우, 타당성이 입증되지 않는 한 해당 세포배양 제품 수확물은 제품 제조에 사용하여서는 아니 된다. (수확물에서 외래성 바이러스가 검출된 물질의 사용에 관한 지침은 5절 참조.) 오염의 근본 원인과 범위를 확인하기 위해 공정을 면밀히 점검하여야 하며, 적절한 조치를 취하여야 한다. CM 공정의 경우, 배치의 최종 출하승인에는 해당 배치의 제조를 위해 배양액을 수확한 기간 동안 바이러스 오염이 없었음을 문서화한 내용이 포함되어야 한다. 외래성 바이러스가 검출되는 경우, 생산 전반으로 영향이 확대되는 것을 완화하기 위해 잠재적으로 오염된 물질을 격리하는 절차를 수립하여야 한다.

If any adventitious viruses are detected at the unprocessed bulk stage, the product harvest from cell culture should not be used for product manufacture unless justified. (See Section 5 for guidance on the use of material in which an adventitious virus has been detected in the harvest material.) The process should be carefully checked to determine the root cause and extent of the contamination, and appropriate actions should be taken. For CM processes, final release of a batch should include documented absence of viral contamination for the period during which cultivation fluids were harvested for manufacture of that batch. If an adventitious virus is detected, a procedure to segregate potentially contaminated material should be established to mitigate a wider production effect.

마스터세포은행(MCB) 단계에서부터 의약품 생산의 여러 단계를 거쳐 최종 제품에 이르기까지, 미정제 원액(unprocessed bulk)으로부터의 바이러스 제거(viral clearance)에 대한 평가 및 특성분석을 포함하여, 바이러스 시험을 위한 가장 적절하고 합리적인 시험계획서를 설계하는 것이 중요하다. 바이러스 제거에 대한 평가 및 특성분석은 이 체계에서 핵심적인 역할을 한다. 목표는 제품에 바이러스 오염이 없다는 보증을 얻는 것이어야 한다.

It is important to design the most relevant and rational protocol for virus tests from the MCB level, through the various steps of drug production, and to the final product including evaluation and characterisation of viral clearance from unprocessed bulk. The evaluation and characterisation of viral clearance plays a critical role in this scheme. The goal should be to obtain assurance that the product is free of virus contamination.

바이러스 제거 시험에 사용할 바이러스를 선정할 때에는, 존재하는 것으로 알려진 바이러스를 제거하는 능력에 대하여 공정을 평가하는 것과, 비특이 "모델" 바이러스(뒤에서 설명함)의 제거에 대한 특성분석을 통해 공정의 견고성을 추정하는 것을 구별하는 것이 유용하다. "관련" 바이러스, 특이 "모델" 바이러스 및 비특이 "모델" 바이러스의 정의는 용어 해설에 제시되어 있다. 바이러스 위해성 평가에는 제품의 안전성을 평가하기 위하여 공정 중(예: 미정제 원액)에 바이러스가 얼마나 존재할 수 있는지와 얼마나 제거될 수 있는지에 대한 지식이 포함되어야 한다. 불활화(inactivation) 공정의 유효성을 보장하기 위해서는 불활화 절차의 시간 의존성에 대한 지식이 필요하다.

In selecting viruses to use for a clearance study, it is useful to distinguish between evaluating processes for their ability to clear viruses that are known to be present and estimating the robustness of the process by characterising the clearance of non-specific “model” viruses (described later). Definitions of “relevant”, specific, and non-specific “model” viruses are given in the glossary. Viral risk evaluation should include knowledge of how much virus may be present in the process, such as in the unprocessed bulk, and how much can be cleared, to assess product safety. Knowledge of the time dependence for inactivation procedures is necessary in ensuring the effectiveness of the inactivation process.

바이러스 제거를 평가할 때에는 심층적인 시간 의존적 불활화 시험, 불활화 또는 제거(removal)의 재현성 입증, 공정변수 평가를 적절히 수행하여야 한다. 비특이 "모델" 바이러스를 사용하여 제조공정의 제거 견고성을 특성분석하는 경우, 시험 설계 시 비외피 바이러스에 특히 주의를 기울여야 한다("모델" 바이러스에 대한 설명은 6.1.1항 참조). 바이러스 제거 시험의 범위는 세포주 및 미정제 원액에 대한 시험 결과에 따라 영향을 받을 수 있다. 이러한 시험은 아래에 기술한 바에 따라 수행하여야 한다(6항 참조).

When evaluating viral clearance, in-depth time dependent inactivation studies, demonstration of reproducibility of inactivation or removal, and evaluation of process parameters should be performed as appropriate. When a manufacturing process is characterised for robustness of clearance using non-specific “model” viruses, particular attention should be paid to non-enveloped viruses in the study design (see section 6.1.1. for explanation of “model” viruses). The extent of viral clearance studies may be influenced by the results of tests on cell lines and unprocessed bulk. These studies should be performed as described below (see Section 6).

표 4는 세포 또는 미정제 원액에 대한 바이러스 시험 결과에 대응하여 사용되는 조치 계획의 예를 제시한다. 이 계획에는 공정 평가, 바이러스 제거의 특성분석 및 정제 원액에 대한 바이러스 시험이 포함된다. 표에는 여러 사례가 제시되어 있으며 아래에 설명한다. 모든 사례에서 비특이 "모델" 바이러스를 사용한 제거 특성분석을 수행하여야 한다. 가장 일반적인 상황은 사례 A, B 및 F이다. 설치류 레트로바이러스 이외의 바이러스에 오염된 생산 시스템은 통상 사용하지 않는다. 사례 C, D 또는 E에 해당하는 세포주를 사용하여 의약품을 생산할 타당한 근거가 있는 경우에는 이를 해당 규제당국과 협의하여야 한다. 사례 C, D 및 E에서는 해당 바이러스를 제조공정에서 불활화 및/또는 제거하기 위한 밸리데이션되고 효과적인 단계를 갖추는 것이 중요하다.

Table 4 presents an example of an action plan used in response to the results of virus tests on cells or unprocessed bulk. The plan includes the process evaluation and the characterisation of viral clearance and virus tests on purified bulk. Various cases are presented in the table and are described below. In all cases, characterisation of clearance using non-specific “model” viruses should be performed. The most common situations are Cases A, B and F. Production systems contaminated with a virus other than a rodent retrovirus normally are not used. When there are well-justified reasons for drug production using a cell line from Cases C, D, or E, these should be discussed with the appropriate regulatory authorities. In Cases C, D, and E, it is important to have validated and effective steps to inactivate and/or remove the virus in question from the manufacturing process.

사례 A: 원료의약품(예: 바이러스 벡터 입자) 이외의 바이러스, 바이러스 유사입자(virus-like particle, VLP) 또는 레트로바이러스 유사입자(retrovirus-like particle, RVLP)가 세포 또는 미정제 원액에서 확인되지 않은 경우, 앞서 기술한 바와 같이 비특이 "모델" 바이러스를 사용하여 바이러스 제거 및 불활화 시험을 수행하여야 한다. RVLP가 검출되지 않고 PERT 시험이 음성인 경우에는 투여량당 레트로바이러스 입자 수의 추정이 요구되지 않는다.

Case A: When no virus, no virus-like particle (VLP), or no retrovirus-like particle (RVLP) other than the drug substance (e.g., viral vector particles) has been demonstrated in the cells or the unprocessed bulk, virus removal and inactivation studies should be performed with non-specific “model” viruses, as previously stated. If no RVLPs are detected and if the PERT assay is negative, no estimation of retroviral particles per dose is required.

사례 B: 설치류 세포주에서 설치류 레트로바이러스(예: 설치류 A형, C형 및 R형 입자)만 존재하는 경우, 사례 A와 같은 비특이 바이러스 제거 평가에 더하여 특이 "모델" 바이러스(예: 생쥐 백혈병 바이러스(murine leukaemia virus, MLV))를 사용한 공정 평가를 수행하여야 한다. 품목허가를 위해서는 일반적으로 파일럿 규모 또는 상업적 규모의 정제 원액 3개 로트 이상에 대한 RVLP 정량 자료를 제출하여야 한다. CHO, C127, BHK 및 생쥐 하이브리도마 세포주(예: NS0 또는 SP2/0 세포)와 같이 특성이 잘 분석된 세포주는 의약품 생산용 세포기질로 빈번히 사용되어 왔으며, 제품의 바이러스 오염과 관련된 안전성 문제는 보고된 바 없다.

Case B: In rodent cell lines, if only a rodent retrovirus (such as rodent A-, C- and R-type particle) is present, the process evaluation using a specific “model” virus (such as a murine leukaemia virus (MLV)) should be performed in addition to non-specific viral clearance evaluation as in Case A. For marketing authorisation, typically RVLP quantification data from 3 lots or more of purified bulk at pilot plant scale or commercial scale should be provided. Well-characterised cell lines such as CHO, C127, BHK and murine hybridoma cell lines (e.g., NS0 or SP2/0 cells) have frequently been used as substrates for drug production with no reported safety problems related to viral contamination of the products.

내재성 입자가 광범위하게 특성분석되었고 제거가 입증된 이러한 세포주의 경우, 정제 원액 또는 원료의약품에서 비감염성 입자의 존재 여부를 시험하는 것은 통상 권장되지 않는다. 이는 광범위하게 특성분석된 내재성 레트로바이러스 유사입자를 생산하는, 특성이 잘 분석된 다른 세포주(예: Sf9 곤충 세포주)에도 적용된다.

For these cell lines in which the endogenous particles have been extensively characterised and clearance has been demonstrated, it is usually not recommended to test for the presence of the non-infectious particles in the purified bulk or drug substance. This also applies to other well-characterised cell lines (e.g., Sf9 insect cell lines) that produce endogenous retroviral-like particles that have been extensively characterised.

사례 C: 세포 또는 미정제 원액에 인체 감염성의 증거가 없는 바이러스(설치류 레트로바이러스 제외)(예: Sf9 랍도바이러스(Sf9 rhabdovirus))가 함유된 것으로 알려진 경우, 바이러스 제거 및 불활화 평가 시험에는 확인된 해당 바이러스를 사용하여야 한다. 확인된 바이러스를 사용할 수 없는 경우에는 허용 가능한 제거를 입증하기 위하여 "관련" 바이러스 또는 특이 "모델" 바이러스를 사용하여야 한다. 이들 바이러스에 대한 공정 평가의 일부로서, 핵심 불활화 단계에서 확인된 바이러스(또는 "관련" 바이러스나 특이 "모델" 바이러스)의 시간 의존적 불활화 자료를 확보하여야 한다. 정제 원액은 해당 바이러스를 검출하기 위한 특이성과 감도가 높은 적절한 방법으로 시험하여야 한다.

Case C: When the cells or unprocessed bulk are known to contain a virus (other than a rodent retrovirus) for which there is no evidence of infectivity to humans (e.g., Sf9 rhabdovirus), virus removal and inactivation evaluation studies should use the identified virus. If it is not possible to use the identified virus, “relevant” or specific “model” viruses should be used to demonstrate acceptable clearance. Time-dependent inactivation for identified (or “relevant” or specific “model”) viruses at the critical inactivation steps should be obtained as part of the process evaluation for these viruses. Purified bulk should be tested using suitable methods with high specificity and sensitivity for detecting the virus in question.

품목허가를 위해서는 일반적으로 파일럿 규모 또는 상업적 규모로 제조한 정제 원액 3개 배치 이상의 자료를 제출하여야 한다.

For the purpose of marketing authorisation, typically data from 3 batches or more of purified bulk manufactured at pilot plant scale or commercial scale should be provided.

사례 D: 인체 감염성 바이러스(예: 표 3 각주 a에 제시된 바이러스)가 확인된 경우, 해당 제품은 예외적인 상황에서만 허용 가능한 것으로 간주하여야 한다. 이 경우 바이러스 제거 및 불활화 평가 시험에는 확인된 바이러스를 사용하여야 하며, 해당 바이러스 검출을 위하여 특이성과 감도가 높은 특이적 방법을 사용하여야 한다. 확인된 바이러스를 사용할 수 없는 경우에는 "관련" 바이러스 및/또는 특이 "모델" 바이러스(뒤에서 설명함)를 사용하여야 한다. 공정은 다운스트림 공정 중에 선정된 바이러스를 제거하고 불활화하는 것으로 입증되어야 한다. 공정 평가의 일부로서 핵심 불활화 단계에 대한 시간 의존적 불활화 자료를 확보하여야 한다. 정제 원액은 해당 바이러스 검출을 위한 특이성과 감도가 높은 적절한 방법으로 시험하여야 한다.

Case D: If a virus infectious to humans (such as those viruses indicated in Table 3, footnote a), is identified, the product should be considered acceptable only under exceptional circumstances. In such instances, the identified virus should be used for virus removal and inactivation evaluation studies and specific methods with high specificity and sensitivity for the detection of the virus in question should be used. If it is not possible to use the identified virus, “relevant” and/or specific “model” viruses (described later) should be used. The process should be shown to remove and inactivate the selected viruses during downstream processing. Time-dependent inactivation data for the critical inactivation steps should be obtained as part of the process evaluation. Purified bulk should be tested using suitable methods with high specificity and sensitivity for the detection of the virus in question.

품목허가를 위해서는 일반적으로 파일럿 규모 또는 상업적 규모로 제조한 정제 원액 3개 배치 이상의 자료를 제출하여야 한다.

For marketing authorisation, typically data from 3 batches or more of purified bulk manufactured at pilot plant scale or commercial scale should be provided.

사례 E: 현재 이용 가능한 방법론으로 분류할 수 없는 바이러스가 세포 또는 미정제 원액에서 검출된 경우, 해당 바이러스가 병원성일 수 있으므로 그 제품은 통상 허용되지 않는 것으로 간주한다. 이러한 세포주를 사용하여 의약품을 생산할 타당한 근거가 있는 드문 경우에는, 더 진행하기 전에 해당 규제당국과 협의하여야 한다.

Case E: When a virus that cannot be classified by currently available methodologies is detected in the cells or unprocessed bulk, the product is usually considered unacceptable because the virus may be pathogenic. In the rare case in which there are well-justified reasons for drug production using such a cell line, this should be discussed with the appropriate regulatory authorities before proceeding further.

사례 F: 제품 제조에 생산용 바이러스(헬퍼 바이러스, 또는 재조합 단백질이나 VLP 발현용 바이러스 벡터)를 사용하는 경우, 해당 생산용 바이러스 또는 특이 "모델" 바이러스(예: 배큘로바이러스(baculovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 헤르페스바이러스(herpesvirus))를 사용하여 바이러스 제거를 입증하여야 한다. 견고한 과잉 제거능(6.3항)으로 타당성이 입증되지 않는 한, 각 정제 원액에 대하여 생산용 바이러스 부재 시험을 수행하여야 한다. 이 경우 잔류 생산용 바이러스의 부재는 최소 3개 배치의 정제 원액 시험으로 확인하여야 한다.

Case F: When a production virus (helper virus or viral vector for expression of recombinant protein or VLP) is used in product manufacturing, clearance of the virus should be demonstrated using the production virus or a specific “model” virus (e.g., baculovirus, adenovirus, herpesvirus). Testing for the absence of the production virus should be performed for each purified bulk, unless justified by robust excess clearance (Section 6.3). In this case, absence of residual production virus should be confirmed by testing of at least 3 batches of purified bulk.

바이러스 제거 또는 불활화 절차의 평가 및 특성분석은 생명공학의약품의 안전성을 확립하는 데 중요하다. 과거의 오염 사례는 그 존재가 알려지지 않았거나 의심조차 되지 않았던 인자에 의해 발생하였다. 이는 특성이 완전히 분석된 세포주가 아닌 여러 원료물질로 인해 발생한 것이지만, 바이러스 제거 평가가 알려지지 않았고 의심되지 않은 유해 바이러스가 제거될 수 있다는 신뢰의 척도를 제공한다는 점을 강조한다. 시험은 문서화가 잘 되고 관리된 방식으로 수행하여야 한다.

Evaluation and characterisation of virus removal or inactivation procedures are important for establishing the safety of biotechnology products. Past instances of contamination have occurred with agents whose presence was not known or even suspected. Though this happened due to various source materials other than fully characterised cell lines, it reinforces that assessment of viral clearance provides a measure of confidence that any unknown, unsuspected, and harmful viruses may be removed. Studies should be carried out in a well-documented and controlled manner.

바이러스 제거의 공정 특성분석/평가는 세포기질에 내재적으로 존재하는 것으로 알려진 바이러스 또는 생산용 바이러스 사용의 결과로 존재하는 바이러스의 제거를 입증하고, 검출될 수 없었거나 생산 공정에 유입될 수 있는 외래성 바이러스가 제거될 것임을 보장하기 위하여 수행한다. 바이러스 제거 시험의 목적은 (1) 바이러스를 효과적으로 불활화 또는 제거하는 공정 단계를 평가하고, (2) 공정에 의해 얻어지는 전체 바이러스 감소 수준을 정량적으로 추정하는 것이다. 이는 미정제 원액 또는 여러 공정 단계에서 얻은 공정 중간체에 상당량의 바이러스를 의도적으로 첨가(즉, "스파이킹")하고 후속 단계에서 그 제거 또는 불활화를 입증함으로써 달성하여야 한다.

Process characterisation/evaluation of viral clearance is performed to demonstrate the clearance of a virus known to be present endogeneously in the cell substrate, or as a result of using production viruses as well as to ensure that adventitious viruses that could not be detected, or that might enter the production process, would be cleared. The objectives of viral clearance studies are (1) to assess process steps that effectively inactivate or remove viruses; and (2) to estimate quantitatively the overall level of virus reduction obtained by the process. These should be achieved by the deliberate addition (i.e., “spiking”) of significant amounts of virus to the unprocessed bulk or to process intermediates obtained during the various process steps and demonstrating its removal or inactivation during the subsequent steps.

더 적은 수의 단계로 적절한 제거가 입증되는 경우에는 제조공정의 모든 단계를 평가하거나 특성분석할 필요는 없다. 공정의 다른 단계가 달성되는 바이러스 불활화 또는 제거에 간접적인 영향을 미칠 수 있다는 점을 고려하여야 한다. 제조업자는 바이러스 제거 평가 시험에 사용한 접근방식을 설명하고 그 타당성을 입증하여야 한다. 적절한 경우, 정제 공정에 유입되는 바이러스 입자의 양을 결정하기 위하여 3개의 세포배양 로트/배치에 대하여 정량을 수행하여야 한다. 이 자료는 품목허가 신청 자료의 일부로 제출하여야 한다.

It is not necessary to evaluate or characterise every step of a manufacturing process if adequate clearance is demonstrated by using fewer steps. It should be considered that other steps in the process may have an indirect effect on the viral inactivation or removal achieved. Manufacturers should explain and justify the approach used in studies to evaluate viral clearance. When appropriate, to determine the amount of virus particles that enter the purification process, quantification should be performed on three cell cultures lots/batches. These data should be submitted as part of the marketing application.

바이러스 감염성의 감소는 바이러스 입자를 제거하거나 바이러스 감염성을 불활화함으로써 달성될 수 있다. 평가한 각 생산 단계에 대하여, 바이러스 감염성 소실의 가능한 기전을 불활화에 의한 것인지 제거에 의한 것인지에 관하여 기술하여야 한다. 불활화 단계의 경우, 서로 다른 시점에서 검체를 채취하고 불활화 곡선을 작성하도록 시험을 계획하여야 한다(6.2.5항 참조).

The reduction of virus infectivity may be achieved by removing virus particles or by inactivating viral infectivity. For each production step assessed, the possible mechanism of loss of viral infectivity should be described with regard to whether it results from inactivation or removal. For inactivation steps, the study should be planned so that samples are taken at different times and an inactivation curve is constructed (see Section 6.2.5).

존재하는 것으로 알려진 바이러스에 대한 제거 시험에 더하여, 다른 바이러스를 제거 또는 불활화하는 능력을 특성분석하는 시험을 수행하여야 한다. 다양한 생화학적·생물물리학적 특성을 가진 바이러스를 사용하는 시험의 목적은 특정 불활화 또는 제거 목표를 달성하는 것이 아니라, 존재하는 것으로 알려지지 않았거나 존재할 것으로 예상되지 않는 바이러스를 제거하는 절차의 견고성을 특성분석하는 것이다. 생산 공정의 바이러스 불활화 또는 제거 능력을 입증하는 것이 바람직하다(6.3항 참조). 이러한 시험은 특정 안전성 위험을 평가하기 위하여 수행하는 것이 아니므로, 특정 제거값을 달성할 필요는 없다.

In addition to clearance studies for viruses known to be present, studies to characterise the ability to remove or inactivate other viruses should be conducted. The purpose of studies using viruses with diverse biochemical and biophysical properties is to characterise the robustness of the procedure to clear viruses that are not known or not expected to be present rather than to achieve a specific inactivation or removal goal. A demonstration of the capacity of the production process to inactivate or remove viruses is desirable (see Section 6.3). Such studies are not performed to evaluate a specific safety risk, therefore, achieving a specific clearance value is not needed.

제거 평가 및 공정 특성분석 시험에 사용할 바이러스는 제품을 오염시킬 수 있는 바이러스와 유사하고, 시스템의 일반적인 바이러스 제거 능력을 시험할 수 있도록 광범위한 물리화학적 특성을 대표하도록 선정하여야 한다. 제조업자는 이 가이드라인에 제시된 평가 및 특성분석 시험의 목적에 따라 바이러스 선정의 타당성을 입증하여야 한다.

Viruses for clearance evaluation and process characterisation studies should be chosen to resemble viruses which may contaminate the product and to represent a wide range of physicochemical properties to test the ability of the system to eliminate viruses in general. The manufacturer should justify the choice of viruses according to the aims of the evaluation and characterisation study provided in this guideline.

바이러스 제거 시험 수행 시 주요 쟁점은 어떤 바이러스를 사용할지 결정하는 것이다. 이러한 바이러스는 (1) "관련" 바이러스, (2) 특이 "모델" 바이러스, (3) 비특이 "모델" 바이러스의 세 범주로 나뉜다. "관련" 바이러스는 바이러스 제거 시험에 사용된다. "관련" 바이러스는 확인된 바이러스이거나 확인된 바이러스와 동일한 종의 바이러스, 또는 세포기질이나 생산 공정에 사용되는 기타 시약 또는 물질을 오염시킬 가능성이 있는 바이러스이다. 다운스트림 공정은 이러한 바이러스를 제거 및/또는 불활화하는 능력을 입증하여야 한다. "관련" 바이러스를 이용할 수 없거나 바이러스 제거 시험의 공정 평가에 잘 적합하지 않은 경우(예: 시험관내에서 충분히 높은 역가로 증식시킬 수 없는 경우)에는 특이 "모델" 바이러스를 대체물로 사용하여야 한다.

A major issue in performing a viral clearance study is to determine which viruses should be used. Such viruses fall into three categories: (1) “relevant” viruses, (2) specific “model” viruses, and (3) non-specific “model” viruses. “Relevant” viruses are used in the viral clearance studies. “Relevant” viruses are the identified viruses or of the same species as the viruses that are identified, or likely to contaminate the cell substrate or any other reagents or materials used in the production process. The downstream process should demonstrate the capability to remove and/or inactivate such viruses. When a “relevant” virus is not available or when it is not well adapted to the process evaluation of viral clearance studies (e.g., it cannot be grown in vitro to sufficiently high titres), a specific “model” virus should be used as a substitute.

적절한 특이 "모델" 바이러스는 알려져 있거나 의심되는 바이러스와 밀접하게 관련되고(동일한 속 또는 과), 관찰되었거나 의심되는 바이러스와 유사한 물리적·화학적 특성을 가진 바이러스일 수 있다. 설치류 유래 세포주는 통상 내재성 레트로바이러스 또는 RVLP를 함유하며, 이는 감염성(C형 입자)이거나 비감염성(세포질 A형 및 R형 입자)일 수 있다. 이러한 세포에서 얻은 제품으로부터 설치류 레트로바이러스를 제거 및/또는 불활화하는 제조공정의 능력을 결정하여야 한다. 이는 설치류 유래 세포의 경우 특이 "모델" 바이러스인 생쥐 백혈병 바이러스를 사용하여 수행할 수 있다.

An appropriate specific “model” virus can be a virus which is closely related to the known or suspected virus (same genus or family), having similar physical and chemical properties to the observed or suspected virus. Cell lines derived from rodents usually contain endogenous retroviruses or RVLPs, which may be infectious (C-type particles) or non-infectious (cytoplasmic A- and R-type particles). The capacity of the manufacturing process to remove and/or inactivate rodent retroviruses from products obtained from such cells should be determined. This can be accomplished by using a murine leukaemia virus—a specific “model” virus in the case of cells of rodent origin.

CHO 세포 유래 제품의 경우, CHO 유래 내재성 바이러스 입자도 바이러스 제거 실험에 사용할 수 있다. 이러한 입자에 대한 감염성 시험은 없으며, 검출 시험(예: 분자생물학적 또는 생화학적 시험)은 의도한 용도에 대하여 적격성 평가를 하여야 한다. 인간 세포주가 엡스타인-바 바이러스(Epstein-Barr virus)에 의한 B 림프구의 불멸화로 얻어진 경우, 헤르페스 바이러스를 제거 및/또는 불활화하는 제조공정의 능력을 결정하여야 한다. 가성광견병 바이러스(pseudorabies virus)도 특이 "모델" 바이러스로 사용할 수 있다.

For CHO cell-derived products, CHO-derived endogenous virus particles can also be used for viral clearance experiments. There is no infectivity assay for these particles, and the detection assay (e.g., molecular or biochemical) should be qualified for its intended use. When human cell lines have been obtained by the immortalisation of B lymphocytes by Epstein-Barr virus, the ability of the manufacturing process to remove and/or inactivate a herpes virus should be determined. Pseudorabies virus may also be used as a specific “model” virus.

바이러스 전반을 제거 및/또는 불활화하는 제조공정의 능력을 특성분석하는 것(즉, 제거 공정의 견고성을 특성분석하는 것)이 목적인 경우에는, 서로 다른 특성을 가진 비특이 "모델" 바이러스로 바이러스 제거 특성분석 시험을 수행하여야 한다. "관련" 바이러스 및/또는 특이 "모델" 바이러스를 사용한 시험에서 얻은 자료도 이 평가에 기여할 수 있다. 모든 유형의 바이러스를 시험할 필요는 없다. 물리적 및/또는 화학적 처리에 상당한 내성을 보이는 바이러스를 우선적으로 고려하여야 한다. 이러한 바이러스에 대해 얻은 결과는 바이러스 전반을 제거 및/또는 불활화하는 생산 공정의 능력에 관한 유용한 정보를 제공한다. 사용하는 바이러스의 선정과 수는 세포주 및 생산 공정의 품질과 특성분석 정도에 따라 정하여야 한다.

When the purpose is to characterise the capacity of the manufacturing process to remove and/or inactivate viruses in general (i.e., to characterise the robustness of the clearance process), viral clearance characterisation studies should be performed with non-specific “model” viruses with differing properties. Data obtained from studies with “relevant” and/or specific “model” viruses can also contribute to this assessment. It is not necessary to test all types of viruses. Preference should be given to viruses that display a significant resistance to physical and/or chemical treatments. The results obtained for such viruses provide useful information about the ability of the production process to remove and/or inactivate viruses in general. The choice and number of viruses used should be influenced by the quality and characterisation of the cell lines and the production process.

일반적으로 공정은 서로 다른 특성을 가진 최소 3종의 바이러스를 제거하는 능력에 대하여 평가하여야 한다.

Generally, the process should be assessed for its ability to clear at least three different viruses with differing characteristics.

부록 1 및 표 A-1은 다양한 물리화학적 구조를 대표하는 유용한 "모델" 바이러스의 예와 바이러스 제거 시험에 사용되어 온 바이러스의 예를 제시한다.

Annex 1 and Table A-1 provide examples of useful “model” viruses representing a range of physicochemical structures and examples of viruses that have been used in viral clearance studies.

추가로 고려하여야 할 사항은 다음과 같다.

Additional points to be considered:

GMP(의약품 제조 및 품질관리기준)상의 제약으로 인해 의도하지 않은 바이러스를 생산 시설에 도입하는 것은 부적절하다. 따라서 바이러스 제거 시험은 바이러스학 작업을 위한 설비를 갖춘 별도의 실험실에서 수행하여야 하며, 정제 공정의 축소 모델(scale-down model)을 설계하고 준비하는 데 관여하는, 해당 공정에 경험이 있는 생산 인력과 협력하여 바이러스학 전문성을 갖춘 직원이 수행하여야 한다.

It is inappropriate to introduce any unintended virus into a production facility because of good manufacturing practice constraints. Therefore, viral clearance studies should be conducted in a separate laboratory equipped for virological work and performed by staff with virological expertise in collaboration with production personnel with experience in the specific process involved in designing and preparing a scale-down model of the purification process.

축소 모델의 대표성을 입증하여야 하며, 축소 모델은 생산 공정을 가능한 한 가깝게 대표하여야 한다. 축소 모델은 바이러스 제거의 견고성(즉, 부정적 영향 없이 물질의 변동성과 공정 변경을 견디는 공정 또는 공정 단계의 능력)도 고려하여야 한다. 이와 관련하여 관련 변수에 대한 최악 조건(worst-case condition)에서 바이러스 제거 시험을 수행하는 것이 바람직할 수 있다. 바이러스 제거의 견고성을 입증하고 향후 있을 수 있는 제조 변경에 대비하기 위하여 조건이 운전 범위를 벗어나는 것도 허용될 수 있다. 축소 모델의 성능이 생산 공정을 대표한다는 것(예: 동등한 수율 및 순도)을 입증하여야 한다.

The representativeness of the scale-down model should be demonstrated and should represent the production process as closely as possible. The scale-down model should also consider the robustness of viral clearance (i.e., ability of a process or process step to tolerate variability of materials and changes of the process without negative impact). In this context, it can be advisable to perform viral clearance studies under worst-case conditions for relevant parameters. It can also be acceptable that conditions may be outside of an operating range in order to demonstrate the robustness of viral clearance and to be prepared for potential manufacturing changes. The performance of the scale-down model should be demonstrated to represent the production process (e.g., comparable yield and purity).

예를 들어 크로마토그래피 단계의 경우, 컬럼 충전 높이, 선유속, 유속 대 충전 부피 비(즉, 접촉 시간), 완충액 및 레진 종류, pH, 온도, 전도도 및 제품 농도가 상업적 규모의 제조를 대표함을 보여야 한다. 유사한 크로마토그램이 얻어져야 한다. 다른 절차에도 유사한 고려사항이 적용된다. 불가피한 차이는 결과에 미치는 영향과 관련하여 논의하여야 한다.

For chromatographic steps, for example, column bed-height, linear flow-rate, flow-rate-to-bed-volume ratio (i.e., contact time), buffer and resin types, pH, temperature, conductivity and concentration of product should be shown to be representative of commercial-scale manufacturing. A similar chromatogram should result. For other procedures, similar considerations apply. Unavoidable deviations should be discussed with regard to their influence on the results.

바이러스 제거 시험을 수행할 때에는 둘 이상의 생산 단계가 바이러스 제거에 기여하는 정도를 평가하는 것을 고려하여야 한다. 바이러스를 제거할 가능성이 있는 단계는 바이러스를 제거 또는 불활화하는 능력에 대하여 개별적으로 평가하여야 하며, 개별 단계의 정확한 정의를 고려하여야 한다. 각 단계의 유효성을 적절히 평가할 수 있도록, 시험할 각 단계의 물질에 충분한 바이러스가 존재하여야 한다. 일반적으로 바이러스는 시험할 각 단계의 공정 중간체에 첨가하여야 한다. 경우에 따라 초기 공정 중간체에 고역가 바이러스를 첨가하고 후속 단계 사이에서 그 농도를 시험하는 것이 타당할 수 있다. 바이러스 제거가 분리 절차에 의한 것인 경우, 적절하고 가능하다면 여러 분획에서의 바이러스 부하 분포를 조사하는 것이 권장된다.

When viral clearance studies are performed, assessment of the contribution of more than one production step to virus elimination should be considered. Steps that are likely to clear virus should be individually assessed for their ability to remove or inactivate virus, and the exact definition of an individual step should be considered. Sufficient virus should be present in the material of each step to be tested so that an adequate assessment of the effectiveness of each step is obtained. Generally, virus should be added to process intermediate at each step to be tested. In some cases, adding high titre virus to an early process intermediate and testing its concentration between subsequent steps can be justified. When virus removal results from separation procedures, it is recommended that the distribution of the virus load in the different fractions be investigated, if appropriate and if possible.

바이러스를 불활화하는 완충액이 제조공정 내에서 사용되는 경우, 전체 공정 평가의 일부로서 바이러스 불활화 작용이 덜한 완충액(예: pH를 조정한 완충액)에서의 병행 스파이킹(바이러스 첨가)과 같은 대체 전략을 수행할 수 있다. 완충액 자체에 의한 불활화는 별도의 스파이킹 실험에서 시험할 수 있다. 바이러스 입자의 분배를 결정하기 위하여 감염성과 무관한 정량 시험을 적용할 수 있다. 평가 대상인 각 단계 전후의 바이러스 역가를 측정하여야 한다. 정량적 감염성 시험은 적절한 감도와 재현성을 가져야 하며, 결과의 적절한 통계적 타당성을 보장할 수 있도록 충분한 반복으로 수행하여야 한다. 타당성이 입증되는 경우 감염성과 무관한 정량 시험을 사용할 수 있다. 방법의 감도를 보장하기 위하여 모든 감염성 시험에 적절한 바이러스 대조군을 포함하여야 한다.

When buffers which inactivate viruses are used within the manufacturing process, alternative strategies such as parallel spiking in less virus-inactivating buffers (e.g., in pH adjusted buffer), can be carried out as part of the overall process assessment. Inactivation by the buffer itself might be tested in separate spiking experiments. Using quantitative assays not associated with infectivity may be applicable in order to determine partitioning of viral particles. The virus titre before and after each step being evaluated should be determined. Quantitative infectivity assays should have adequate sensitivity and reproducibility and should be performed with sufficient replicates to ensure adequate statistical validity of the result. Quantitative assays not associated with infectivity may be used if justified. Appropriate virus controls should be included in all infectivity assays to ensure the sensitivity of the method.

또한 저농도 바이러스 검체 채취의 통계를 고려하여야 한다(부록 2 참조).

Also, the statistics of sampling virus when at low concentrations should be considered (see Annex 2).

일반 원칙으로서, 사전 지식에 의해 시험 축소의 타당성이 입증되지 않는 한(6.6항 참조), 재현성 있는 바이러스 제거를 최소 2회의 독립적인 실험으로 확인하여야 한다. 두 독립적인 실험이 동일하게 수행될 것으로 기대되지는 않으나, 실험은 동일한 장소에서 동일한 실험 설정과 동일한 로트의 공정 중 물질을 사용하여 수행할 수 있다.

As a general principle, reproducible viral clearance should be confirmed in at least two independent experiments, unless a reduction of studies is justified by prior knowledge (see Section 6.6). Experiments may be performed at the same site, using the same experimental setting and with the same lot of in process material although it is not expected that the two independent experiments are performed identically.

감염성 바이러스의 감소는 바이러스의 제거 또는 불활화에 의해 달성될 수 있다. 평가한 각 생산 단계에 대하여, 바이러스 감염성 소실의 가능한 기전을 불활화 및/또는 제거와 관련하여 기술하여야 한다. 특정 단계에 대해서는 제거와 불활화를 구분할 필요가 있을 수 있다. 예를 들어, 둘 이상의 제거 단계에서 사용되는 완충액이 각 단계에서 불활화에 기여할 가능성이 있는 경우(즉, 여러 크로마토그래피 단계가 공유하는 완충액에 의한 불활화 기여), 이들 각 크로마토그래피 단계에서 달성된 제거를 구분하여야 한다.

Reduction of infectious virus can be achieved by the removal or inactivation of virus. For each production step assessed, the possible mechanism of the loss of viral infectivity should be described as related to inactivation and/or removal. It may be necessary to distinguish between removal and inactivation for a particular step. As an example, when there is a possibility that a buffer used in more than one clearance step may contribute to inactivation during each step (i.e., the contribution to inactivation by a buffer shared by several chromatographic steps), the clearance achieved by each of these chromatographic steps should be distinguished.

바이러스 불활화 평가를 위해서는 공정 중간체에 감염성 바이러스를 스파이킹하고 감소지수(reduction factor)를 계산하여야 한다. 바이러스 불활화는 단순한 1차 반응이 아니며, 통상 초기의 빠른 단계와 이후의 느린 단계로 이루어진 더 복잡한 반응임을 인식하여야 한다. 따라서 서로 다른 시점에서 검체를 채취하고 불활화 곡선을 작성하도록 시험을 계획하여야 한다. 불활화 시험에는 최소 노출 시간에 더하여, 0보다 크고 최소 노출 시간보다 짧은 시점을 최소 하나 포함하는 것이 권장된다. 추가 자료는 해당 바이러스가 인체 병원체로 알려진 "관련" 바이러스이고 효과적인 불활화 공정을 설계하는 경우에 특히 중요하다.

For the assessment of viral inactivation, process intermediate should be spiked with infectious virus and the reduction factor calculated. It should be recognised that virus inactivation is not a simple first order reaction and is usually more complex with an initial fast phase and a subsequent slow phase. Therefore, the study should be planned in such a way that samples are taken at different times and an inactivation curve be constructed. It is recommended that studies for inactivation include at least one time point less than the minimum exposure time and greater than zero, in addition to the minimum exposure time. Additional data are particularly important if the virus is a “relevant” virus known to be a human pathogen, and an effective inactivation process is being designed.

그러나 비특이 "모델" 바이러스를 사용하는 불활화 시험, 또는 CHO RVLP와 같은 바이러스 입자의 대체물로 특이 "모델" 바이러스를 사용하는 경우에는, 일반적으로 2회의 독립적인 시험에서 재현성 있는 제거를 입증하여야 한다. 가능한 경우 언제나 초기 바이러스 부하는 스파이킹된 출발 물질에서 검출될 수 있는 바이러스로부터 결정하여야 한다. 이것이 가능하지 않은 경우, 초기 바이러스 부하는 스파이킹용 바이러스 조제물의 역가로부터 계산할 수 있다. 불활화가 너무 빨라 공정 조건에서 불활화 곡선을 작성할 수 없는 경우, 감염성이 실제로 불활화에 의해 소실되었음을 입증하기 위하여 적절한 대조(예: 불활화제의 농도를 낮춘 검체)를 수행하여야 한다.

However, for inactivation studies in which non-specific “model” viruses are used or when specific “model” viruses are used as surrogates for virus particles such as the CHO RVLPs, reproducible clearance should be demonstrated in typically two independent studies. Whenever possible, the initial virus load should be determined from the virus which can be detected in the spiked starting material. If this is not possible, the initial virus load may be calculated from the titre of the spiking virus preparation. When inactivation is too rapid to plot an inactivation curve using process conditions, appropriate controls (e.g., samples with lower concentration of the inactivating agent) should be performed to demonstrate that infectivity is indeed lost by inactivation.

정제 공정에서 사용되는 크로마토그래피 레진 및 막의 바이러스 제거 능력은 시간이 지나고 반복 사용함에 따라 달라질 수 있다. 크로마토그래피 매질/레진의 사용 수명을 명시하여야 하며, 바이러스 제거에 영향을 미칠 가능성이 있는 변수를 규정하여야 한다. 매질/레진 재사용을 뒷받침하기 위하여 바이러스 제거 시험을 수행하여야 한다.

Over time and after repeated use, the ability of chromatography resins and membranes used in the purification process to clear virus may vary. Chromatography media/resin lifetime use should be indicated, and parameters with potential impact on viral clearance should be defined. Viral clearance studies should be performed to support media/resin reuse.

단백질 A 친화 포획 크로마토그래피의 경우, 사전 지식(prior knowledge)에 따르면 사용된(예: 수명 말기) 크로마토그래피 매질/레진에서 바이러스 제거는 영향을 받지 않거나 약간 증가한다. 따라서 사용된 레진을 이용한 제품 특이적 시험은 요구되지 않는다. 사전 지식은 바이러스 제거에 관여하는 다른 크로마토그래피 유형(예: 음이온 교환 또는 양이온 교환)에도 적용될 수 있다. 이에 따라 다른 크로마토그래피 유형에 대해 레진 반복 사용을 뒷받침하기 위한 수명 말기 레진의 제품 특이적 시험이 필요하지 않은 것으로 판단되는 경우에는, 사내 경험을 포함한 동등한 사전 지식과 상세한 타당성 근거를 제시하여야 한다(6.6항).

For Protein A affinity capture chromatography, prior knowledge indicates that virus removal is not affected or slightly increases for used (e.g., end of life) chromatography media/resin. Therefore product-specific studies with used resin are not expected. Prior knowledge might also apply to other chromatography types involved in viral clearance (e.g., anion exchange or cation exchange). Accordingly, in cases where product-specific studies with end of lifetime resin are not considered necessary to support repeated resin use for other chromatography types, equivalent prior knowledge including in-house experience and a detailed justification should be provided (Section 6.6).

생산 시스템에 잔류할 가능성이 있는 바이러스가 시스템 재사용 전에 적절히 불활화 또는 제거될 것이라는 보증을 제공하여야 한다. 예를 들어, 세척 및 재생 절차가 바이러스를 불활화 또는 제거함을 입증하는 증거를, 예컨대 바이러스 제거 평가 중에 제시할 수 있으며, 이는 사전 지식으로 뒷받침될 수 있다.

Assurance should be provided so that any virus potentially retained by the production system would be adequately inactivated or removed before reusing the system. For example, evidence may be provided demonstrating that the cleaning and regeneration procedures inactivate or remove virus for example, during viral clearance evaluation and this may be supported by prior knowledge.

다음의 특별 주의사항을 고려하여야 한다.

The following specific precautions should be considered:

바이러스 불활화/제거 평가의 목적은 바이러스 불활화/제거에 효과적인 것으로 판단되는 공정 단계를 평가 및 특성분석하고, 제조공정에 의해 얻어지는 전체 바이러스 감소 수준을 정량적으로 추정하는 것이다. 사례 B부터 F까지와 같은 바이러스의 경우, 바이러스가 제거 또는 불활화된다는 것뿐만 아니라, 최종 제품의 적절한 바이러스 안전성 수준을 보장하기 위하여 다운스트림 공정에 바이러스 제거를 위한 과잉 능력이 내재되어 있음을 보이는 것이 중요하다. 제조공정에 의해 제거 또는 불활화되는 바이러스의 양을 다운스트림 공정에 유입될 수 있는 바이러스의 양과 비교하여야 한다.

The objective of assessing virus inactivation/removal is to evaluate and characterise process steps considered effective in inactivating/removing viruses and to estimate quantitatively the overall level of virus reduction obtained by the manufacturing process. For viruses, as in cases B through F, it is important to show that not only is the virus removed or inactivated, but that there is excess capacity for viral clearance built into the downstream process to ensure an appropriate level of viral safety for the final product. The amount of virus removed or inactivated by the manufacturing process should be compared to the amount of virus which may be entering the downstream process.

이 비교를 수행하기 위해서는 미정제 원액 중 바이러스의 양을 추정하는 것이 중요하다. 이 추정치는 감염성 시험 또는 투과전자현미경(TEM)이나 이에 상응하는 정량적 핵산증폭시험(NAT)과 같은 기타 방법을 사용하여 얻어야 한다. 전체 정제 공정은 미정제 원액의 1회 투여량 상당량에 존재하는 것으로 추정되는 양보다 상당히 많은 바이러스를 제거할 수 있어야 한다. 바이러스 감소지수 계산은 부록 3을, 투여량당 추정 입자 수 계산은 부록 4를 참조한다. 제조업자는 제거 기전이 바이러스 부류에 따라 다를 수 있음을 인식하여야 한다. 바이러스 불활화/제거 절차의 유효성을 뒷받침하는 자료를 판단할 때에는 여러 요인을 종합적으로 고려하여야 한다. 이러한 요인은 다음과 같다.

To carry out this comparison, it is important to estimate the amount of virus in the unprocessed bulk. This estimate should be obtained using assays for infectivity or other methods such as TEM or a comparable quantitative NAT. The entire purification process should be able to eliminate substantially more virus than is estimated to be present in a single-dose-equivalent of unprocessed bulk. See Annex 3 for calculation of virus reduction factors and Annex 4 for calculation of estimated particles per dose. Manufacturers should recognise that clearance mechanisms may differ among virus classes. A combination of factors should be considered when judging the data supporting the effectiveness of virus inactivation/removal procedures. These include:

광범위한 잠재적 바이러스(잠재적 외래성 바이러스 오염물질, 내재성 바이러스 및/또는 생산용 바이러스)를 제거하는 다운스트림 공정을 설계하는 것이 권장된다. 이와 관련하여, 실행 가능하고 제품에 부정적 영향을 미치지 않는 경우에는 언제나, 작용 방식이 서로 상호보완적인 두 가지의 서로 다른 바이러스 제거 단계를 도입하는 것이 권장되며, 그중 하나는 비외피 바이러스에 대해 효과적인 제거를 제공하여야 한다. 효과적인 바이러스 제거 단계는 일반적으로 최소 2회의 독립적인 시험으로 입증된 4 log₁₀ 이상 수준의 재현성 있는 바이러스 부하 감소를 나타낸다. 그러나 1~3 log₁₀의 재현성 있는 감소를 나타내는 단계도 바이러스 안전성에 기여하며 전체 바이러스 감소 평가에 고려될 수 있음이 인정된다.

It is recommended to design a downstream process that clears a wide range of potential viruses (potential adventitious virus contaminants, endogenous and/or production virus). In this context, whenever feasible and not adversely affecting the product, implementing two distinct viral clearance steps, one of which should provide effective clearance of non-enveloped virus, that complement each other in their mode of action is recommended. An effective viral clearance step generally gives reproducible reduction of virus load in the order of 4 log₁₀ or more shown by at least two independent studies. However, it is recognised that steps giving a reproducible reduction of 1 to 3 log₁₀ contribute towards viral safety and can be considered for assessment of overall virus reduction.

용매/계면활성제(S/D) 처리, 계면활성제 단독 처리 또는 저pH 처리와 같이 바이러스 불활화/제거 전용 공정 단계는 광범위한 외피 바이러스의 제거에 매우 성공적이었으며, 바이러스 여과는 크기에 근거하여 바이러스를 제거한다. 소형 바이러스 제거용으로 설계된 바이러스 필터의 사용은 파보바이러스(parvovirus)나 폴리오마바이러스(polyomavirus)와 같은 소형 바이러스에 대해서도 효과적인 바이러스 제거 단계이다. 끝으로, 단일클론항체(mAb) 정제를 위한 단백질 A 포획 단계 이후의 저pH 처리에 의해 MLV 및 가성광견병 바이러스가 효율적으로 불활화된 경험이 있다.

Process steps dedicated to virus inactivation/removal such as solvent/detergent treatment, treatment with detergent alone, or incubation at low pH, have been very successful in clearing a wide range of enveloped viruses and virus filtration removes viruses based on their size. Using virus filters designed for removal of small viruses is also an effective viral clearance step for the smaller viruses such as parvovirus or polyomaviruses. Finally, there is experience of efficient inactivation of MLV and pseudorabies virus by incubation at low pH after the Protein A capture step for purification of mAbs.

허용 가능한 전체 제거는 다음 중 어느 방식으로든 달성될 수 있다. 상호보완적인 복수의 불활화 단계, 상호보완적인 복수의 제거(분리) 단계, 또는 불활화 단계와 제거 단계의 조합. 바이러스 제거 방법은 크로마토그래피 고정상(예: 레진 또는 크로마토그래피 막)과의 상호작용 및 침전 특성에 영향을 미치는 바이러스의 극히 특이적인 물리화학적 특성에 의존할 수 있다. 따라서 "모델" 바이러스는 "관련" 바이러스와 다른 방식으로 분리될 수 있다. 제거에 영향을 미치는 제조 변수를 적절히 규정하고 관리하여야 한다. 이러한 잠재적 변수에도 불구하고, 상호보완적인 제거 단계의 조합 또는 불활화 단계와 제거 단계의 조합에 의해 효과적인 제거를 얻을 수 있다.

Acceptable overall clearance can be achieved by any of the following steps: multiple complementary inactivation steps, multiple complementary removal (separation) steps, or combinations of inactivation and removal steps. Virus removal methods may be dependent on the extremely specific physicochemical properties of viruses which influence their interaction with stationary phases for chromatography (e.g., resins or chromatography membranes) and their precipitation properties. Therefore “model” viruses can be separated in a different manner than a “relevant” virus. Manufacturing parameters influencing removal should be properly defined and controlled. Despite these potential variables, effective clearance can be obtained by a combination of complementary removal steps or combinations of inactivation and removal steps.

따라서 크로마토그래피 절차, 여과 단계 및 추출과 같이 잘 설계된 제거 단계는 적절히 관리된 조건에서 수행되는 경우 효과적인 바이러스 제거 단계가 될 수 있다.

Therefore, well designed removal steps, such as chromatographic procedures, filtration steps and extractions, can be effective virus removal steps provided that they are performed under appropriately controlled conditions.

총 감소지수는 일반적으로 개별 감소지수의 합으로 표현한다. 그러나 1 log₁₀ 미만의 바이러스 부하 감소는 무시할 만한 것으로 간주하며, 타당성이 입증되지 않는 한 고려하지 않아야 한다.

An overall reduction factor is generally expressed as the sum of the individual factors. However, reduction in virus load less than 1 log₁₀ is considered negligible and should be ignored unless justified.

생산 공정에 의해 달성되는 감염성 감소가 적고 바이러스 제거가 제품 안전성의 주요 요인으로 간주되는 경우에는, 특정한 추가 불활화/제거 단계를 하나 이상 도입하여야 한다. 모든 바이러스에 대하여 제조업자는 얻어진 감소지수의 허용 가능성에 대한 타당성을 입증하여야 한다. 결과 평가 시에는 위에 열거한 요인을 고려한다.

If little reduction of infectivity is achieved by the production process, and the removal of virus is considered to be a major factor in the safety of the product, a specific, additional inactivation/removal step or steps should be introduced. For all viruses, manufacturers should justify the acceptability of the reduction factors obtained. The factors listed above will be considered in evaluating the results.

바이러스 제거 시험은 최종 제품에서 허용 가능한 수준의 안전성이 달성된다는 보증에 기여하는 데 유용하지만, 그 자체로 안전성을 확립하지는 않는다. 바이러스 제거 시험의 설계 및 수행에 관한 여러 요인으로 인해 바이러스 감염성을 제거하는 공정 능력이 잘못 추정될 수 있다. 이러한 요인은 다음과 같다.

Viral clearance studies are useful for contributing to the assurance that an acceptable level of safety in the final product is achieved but do not by themselves establish safety. A number of factors in the design and execution of viral clearance studies may lead to an incorrect estimate of the ability of the process to remove virus infectivity. These factors include the following:

바이러스 제거 시험에는 결과 평가를 위한 자료의 통계적 분석이 포함되어야 한다. 시험 결과는 도출된 결론을 뒷받침할 수 있도록 통계적으로 타당하여야 한다(부록 2 참조).

The viral clearance studies should include the use of statistical analysis of the data to evaluate the results. The study results should be statistically valid to support the conclusions reached (refer to Annex 2).

일반 원칙으로서, 바이러스 제거는 조사 대상인 각 단계의 제품 특이적 공정 중간체에 바이러스를 첨가하는 실험으로 평가한다. 제조업자가 확립되고 특성이 잘 분석된 공정(즉, 동일한 플랫폼 기술 사용)으로 유사 제품을 개발하는 경우, 다른 제품에 대해 생성된 바이러스 제거 자료를 동일한 공정 단계에 대하여 신규 제품에 적용할 수 있다. 그러나 이러한 단계의 자료를 활용하려면 해당 공정 단계를 잘 이해하고 있어야 한다. 특정 공정 단계에 대한 사전 지식의 대표성은 명확히 타당성을 입증하여야 한다. 외부 및 사내 경험을 포함한 사전 지식은 다음 측면을 포괄하여야 한다.

As a general principle, viral clearance is evaluated by experiments when the virus is added to the product-specific process intermediate of each step to be investigated. When a manufacturer is developing similar products by established and well-characterised processes (i.e., using the same platform technology), viral clearance data generated for other products might be applicable to the new product for the same processing step. However, to make use of data from such a step, the process step should be well understood. The representativeness of the prior knowledge for the specific process step should be clearly justified. The prior knowledge including external and in-house experience should cover the aspects outlined below:

외부 사전 지식(공개된 자료 포함)은 어떤 단계의 바이러스 불활화/제거 잠재력을 보여주는 데 보조적 근거가 될 수 있으며, 관련 기전에 대한 통찰을 제공할 수 있다. 이러한 자료는 바이러스 제거에 핵심적인 공정변수를 규정하고, 특정 바이러스 제거 단계에서 시험할 최악 조건의 한계를 설정하는 데에도 사용할 수 있다. 최악 조건에서 바이러스 제거 시험을 수행하면 제품 특이적 실험의 수를 줄이는 데 도움이 될 수 있다. 그러나 공개된 감소지수를 특정 제품에 적용하는 것은, 관련된 서로 다른 제품의 제조에 걸친 공정의 유사성, 제품 중간체의 유사성 및 제품 특이적 특성이 바이러스 감소에 영향을 미치지 않는다는 보증을 입증함으로써 뒷받침되어야 한다. 따라서 공개된 자료는 신중하게 평가하고, 해당 플랫폼에 대한 사내 경험(내부 사전 지식)으로 보완하여야 한다.

External prior knowledge (including published data) can be supportive in indicating the potential of a step to inactivate/remove viruses and can provide insight to the mechanisms involved. Such data can also be used to define the process parameters critical for viral clearance and in setting worst-case limits for testing in a specific viral clearance step. Performing viral clearance studies at worst-case conditions can help reduce the number of product-specific experiments. However, the application of published reduction factors to a specific product should be supported by demonstration of similarity of the processes across manufacture of different products involved, similarity of the product intermediates, and an assurance that product-specific attributes do not affect virus reduction. Therefore, published data should be carefully assessed and supplemented with in-house experience (internal prior knowledge) for a given platform.

제품 특이적 실험 없이 바이러스 제거 자료를 허용할지 여부는 세포기질과 원료의 특성 및 특성분석, 전체 바이러스 제거 전략을 포함하여 의약품의 전체 바이러스 안전성 전략을 고려하면서 사례별로 결정한다. 자료 패키지가 사전 지식의 사용을 충분히 뒷받침하지 못하는 경우에는 제품 특이적 바이러스 제거 시험을 수행하여야 한다.

The decision on the acceptability of viral clearance data without product-specific experiments is made on a case-by-case basis while considering the whole viral safety strategy for a medicinal product, including the nature and characterisation of the cell substrate and raw materials, and the overall viral clearance strategy. If the data package does not sufficiently support the use of prior knowledge, product-specific viral clearance studies should be performed.

사전 지식을 사용하여 감소지수를 주장하는 경우, 관련 플랫폼 자료의 모든 감소지수를 고려하여 그 주장의 타당성을 입증하여야 한다. 공정 단계의 감소 능력을 과대평가할 위험을 피하기 위하여 보수적인 감소지수를 주장하는 것이 권고된다.

When deriving a reduction factor claim using prior knowledge, the claim should be justified considering all reduction factors from the relevant platform data. A conservative reduction factor claim is advised to avoid the risk of overestimating the reduction capacity of the process step.

부록 5는 현재의 이해에 따라, 다른 제품의 바이러스 감소 자료에 대한 사내 경험을 포함한 사전 지식을 사용하여 동일한 제조 플랫폼의 신규 제품에 대한 감소지수를 주장할 수 있는 사례를 제시한다.

Annex 5 provides cases when, according to current understanding, prior knowledge including in-house experience with viral reduction data from other products could be used to claim a reduction factor for a new product from the same manufacturing platform.

업스트림 또는 다운스트림 제조공정에 중대한 변경이 있을 때마다 그 변경이 바이러스 제거에 미치는 직접적·간접적 영향을 고려하고, 필요에 따라 시스템을 재평가하여야 한다. 예를 들어, 업스트림 제조공정의 변경은 세포주가 생산하는 바이러스의 양에 중대한 변화를 일으킬 수 있으며, 공정 단계의 변경은 바이러스 제거 정도를 변화시킬 수 있다.

Whenever significant changes in the upstream or downstream manufacturing processes are made, the effect of that change, both direct and indirect, on viral clearance should be considered and the system re-evaluated, as needed. For example, changes in upstream manufacturing processes may cause significant changes in the amount of virus produced by the cell line; changes in process steps may change the extent of viral clearance.

바이러스 제거 유효성에 영향을 미칠 수 있는 수명주기 관리 중의 제조공정 변경은 내부 지식과 플랫폼 개념을 사용하여 평가할 수 있다. 다른 제품에 대한 내부 지식(사내 경험)을 특정 제품에 외삽할 수 없거나 플랫폼 개념을 더 이상 적용할 수 없는 경우에는 제품 특이적 바이러스 제거 시험을 수행하여야 한다.

Changes in the manufacturing process during life-cycle management that may affect viral clearance efficacy could be evaluated using internal knowledge and the platform concept. If the internal knowledge (in-house experience) with other products cannot be extrapolated to specific products and/or the platform concept can no longer be applied, product-specific viral clearance studies should be performed.

연속 제조(CM)는 투입 물질을 일련의 연결된 단위공정으로 구성된 제조공정에 연속적으로 공급하고, 이 단위공정들이 공급물을 변환하여 산출 물질(즉, 제품)을 연속적인 흐름으로 내보내는 방식을 포함할 수 있다. 연속 제조는 제조공정의 단위공정 일부 또는 전부에 적용할 수 있다. 바이러스 안전성에 대한 위험을 파악하고 완화하려면 각 단위공정뿐 아니라 통합된 공정과 그 동적 특성을 이해하는 것이 필수적이다. 치료용 단백질 제조를 위한 연속 제조 공정의 운전 방식에 대한 설명은 ICH Q13(부속서 III)에서 확인할 수 있다.

CM may involve the continuous feeding of input materials into a manufacturing process comprised of a series of linked unit operations that transform the feed and provide a continuous stream of an output material (i.e., product). CM can be applied to some or all unit operations of a manufacturing process. An understanding of the integrated process and its dynamics, in addition to each unit operation, is essential to identify and mitigate the risk to viral safety. A description of the modes of CM processes for the manufacture of therapeutic proteins can be found in ICH Q13 (Annex III).

바이러스 안전성 측면에서 연속 제조의 기술적 사항은 배치 공정에서 접하는 것과 다를 수 있으며, 여기에는 바이러스의 검출 및 제거 접근법, 물질 추적성, 공정 동적 특성, 그리고 가동 개시/정지 시의 모니터링 빈도가 포함된다.

In terms of viral safety, technical aspects for CM may differ from those encountered in batch processes, including approaches of detection and removal of viruses, material traceability, process dynamics, and monitoring frequency start-up/shutdown.

그러나 공정 이해에 기반한 기본 원칙과 기대 사항(예: 과학 및 위험 기반 접근법과 바이러스 오염 위험을 관리하기 위한 그 이행)은 배치 제조와 동일하다. 이는 오염 방지 전략(2.2절 참조)에도 해당한다. 예를 들어, 배치 생산의 경험 또는 사전 지식에서 도출된 바이러스 불활화 또는 제거를 위한 물리적·화학적 조건은 연속 제조 공정에도 적용할 수 있다(6.6절 참조).

However, basic principles and expectations (such as science- and risk-based approaches and their implementation to control virus contamination risk), that are based on process understanding are the same as for batch manufacturing. This also includes contamination prevention strategies (see Section 2.2). For example, the physical and chemical conditions to inactivate or remove viruses derived from experience or prior knowledge of batch production may also be applicable to CM processes (see Section 6.6).

연속 제조 공정의 바이러스 안전성 전략은 잠재적 오염원(예: 출발물질 및 원료, 연장된 세포배양 기간)에 대한 위해성 평가, 공정의 바이러스 제거 능력, 그리고 바이러스 부재를 보증할 수 있는 시험 능력에 근거하여야 한다. 3절 및 4절에 제시된 시험 관련 지침도 연속 제조에 적용할 수 있는 것으로 본다. 이 평가에 근거하여, 제조 중 공정에 오염이 없음을 입증하기 위해 수행하는 외래성 바이러스 시험의 종류와 빈도를 포함하는 전략을 수립하여야 한다.

The viral safety strategy in CM processes should be based on a risk assessment of potential sources of contamination (e.g., the starting and raw materials and extended cell culture duration), the ability of the process to remove viruses, and the testing capability to assure absence of viruses. Guidance on testing provided in Sections 3 and 4 is also considered applicable to CM. Based on this assessment, a strategy should be developed to include the type and frequency of adventitious virus testing undertaken to demonstrate that the process is free of contamination during manufacturing.

제조공정과 바이러스 제거(viral clearance) 시험을 설계할 때에는 다음을 고려하여야 한다.

To design the manufacturing process and the viral clearance study, the following should be considered:

연속 제조에는 아래에 기술하는 바와 같이 바이러스 안전성과 관련하여 고려해야 할 고유한 측면도 있다.

CM also presents unique aspects to consider for viral safety as described below.

생산 배양에서는 시간이 지남에 따라 내재성 바이러스 수준의 변동이 발생할 수 있으므로, 완제의약품의 투여량 위험 인자 계산에 영향을 주지 않도록 적절한 검체 채취 전략을 평가하여야 한다(세포주 적격성 평가에 관해서는 4절 및 3절의 고려 사항 참조).

Fluctuations in the levels of endogenous virus may occur over time in the production culture so an assessment should be made of the appropriate sampling strategy so as not to affect the dose risk factor calculation for the drug product (see Section 4 and Considerations in Section 3 for cell line qualification).

연속 제조는 관리 상태를 유지할 것으로 기대되지만, 제조공정에는 가동 개시, 종료 및 공정 교란 중에 공정 산출물이 변동될 수 있는 기간(예: 바이러스 오염 시 단기간 동안 잠재적으로 높은 바이러스 부하)이 포함될 수 있다. 이러한 기간에 대한 위험은 이 가이드라인의 다른 부분(6.2절)에서 다룬다.

Although CM is expected to maintain a state of control, the manufacturing process may include periods when the process output may vary during start-up, termination, and process disturbance (e.g., potentially high virus load for a short period of time in case of a virus contamination). The risks for such periods are addressed elsewhere in this guideline (Section 6.2).

또한 장비 설계와 시스템 통합에 따라 둘 이상의 연결된 단위공정을 동시에 밸리데이션하는 것도 하나의 선택지가 될 수 있다.

Furthermore, simultaneous validation of two or more connected unit operations could be an option according to the equipment design and system integration.

연속 제조에 특유한 고려 사항은 다음과 같다.

Considerations specific to CM include:

이 가이드라인은 제품의 바이러스 오염 위험을 평가하고, 잠재적 바이러스 오염원을 관리하며, 바이러스 제거에 대해 제조공정의 적격성을 평가하는 접근법을 권고함으로써 동물 또는 사람 세포주 유래의 안전한 생명공학의약품 생산에 기여한다. 이러한 관리 및 제거 접근법에는 다음이 포함된다.

This guideline recommends approaches for evaluating the risk of viral contamination of the product, controlling potential sources of virus and for qualifying the manufacturing process for viral clearance, thus contributing to the production of safe biotechnology products derived from animal or human cell lines. These control and clearance approaches include:

바이러스 제거 시험에 사용된 바이러스 몇 가지를 표 A-1에 제시하였다. 그러나 이는 예시에 불과하므로 표에 있는 바이러스를 사용하는 것이 의무 사항은 아니며, 제조업자는 다른 바이러스, 특히 각자의 생산 공정에 더 적합할 수 있는 바이러스를 고려하는 것이 바람직하다. 일반적으로 공정은 서로 다른 특성을 가진 3종 이상의 바이러스를 제거하는 능력에 대하여 평가하는 것이 바람직하다.

Several viruses which have been used in viral clearance studies are listed in Table A-1. However, as these are merely examples, the use of any of the viruses in the table is not mandatory and manufacturers are invited to consider other viruses, especially those which may be more appropriate for their individual production processes. Generally, the process should be assessed for its ability to clear three or more different viruses with differing characteristics.

이 바이러스들은 예시일 뿐이며, 그 사용이 의무 사항은 아니다.

These viruses are examples only, and their use is not mandatory.

바이러스 역가 측정은 모든 생물학적 시험계에 공통된 변동의 문제를 안고 있다. 시험의 신뢰성을 규정하기 위하여 바이러스 역가 측정 및 이로부터 산출된 감소지수(reduction factor)의 정확성과 시험의 유효성을 평가하여야 한다. 통계적 평가의 목적은 시험이 허용 가능한 수준의 바이러스학적 역량으로 수행되었음을 입증하는 것이다.

Virus titrations suffer the problems of variation common to all biological assay systems. Assessment of the accuracy of the virus titrations and reduction factors derived from them, and the validity of the assays should be performed to define the reliability of a study. The objective of statistical evaluation is to establish that the study has been carried out to an acceptable level of virological competence.

바이러스 농도가 낮은 경우(예: 리터(L)당 감염성 입자 10~1,000개 범위), 수 밀리리터의 검체에 감염성 입자가 포함될 수도 있고 포함되지 않을 수도 있음은 분명하다. 이 검체가 감염성 바이러스를 포함하지 않을 확률 p는 다음과 같다.

At low virus concentrations (e.g., in the range of 10 to 1,000 infectious particles per litre (L), it is evident that a sample of a few millilitres may or may not contain infectious particles. The probability, p, that this sample does not contain infectious viruses is:

여기서 V(L)는 시험 대상 물질의 전체 부피, v(L)는 검체의 부피, n은 V 내에 통계적으로 분포하는 감염성 입자의 절대 수이다.

When V (L) is the overall volume of the material to be tested, v (L) is the volume of the sample and n is the absolute number of infectious particles statistically distributed in V.

V ≫ v이면 이 식은 푸아송 분포로 근사할 수 있다.

If V >> v, this equation can be approximated by the Poisson distribution:

여기서 c는 L당 감염성 입자의 농도이다.

When c is the concentration of infectious particles per L.

예를 들어, 1 mL의 검체를 시험하는 경우 L당 감염성 입자 10~1,000개 범위의 바이러스 농도에서 확률 p는 다음과 같다.

As an example, if a sample volume of 1 mL is tested, the probabilities p at virus concentrations ranging from 10 to 1,000 infectious particles per L are:

이는 L당 1,000개의 바이러스 농도에서 검체 채취의 37%에서는 1 mL에 바이러스 입자가 포함되지 않음을 나타낸다.

This indicates that for a concentration of 1,000 viruses per L, in 37% of sampling, 1 mL will not contain a virus particle.

검체의 일부만 바이러스 시험을 하여 시험 결과가 음성인 경우, 양성 결과를 얻기 위하여 전체 검체에 존재해야 하는 바이러스의 양을 계산하고, 감소지수를 계산할 때 이 값을 고려하여야 한다. 95% 신뢰한계를 구하는 것이 바람직하다. 그러나 경우에 따라서는 물질의 제약으로 인하여 이것이 실용적이지 않을 수 있다.

If only a portion of a sample is tested for virus and the test is negative, the amount of virus which would be present in the total sample to achieve a positive result should be calculated and this value taken into account when calculating a reduction factor. Confidence limits at 95% are desirable. However, in some instances, this may not be practical because of material limitations.

개별 제거 또는 불활화 단계의 바이러스 감소지수는, 처리 전 물질의 바이러스 부하량과 공정의 다음 단계에 사용할 준비가 된 처리 후 물질의 바이러스 부하량의 비에 대한 log₁₀ 값으로 정의된다. 다음 약어를 사용하는 경우:

The virus reduction factor of an individual removal or inactivation step is defined as the log₁₀ of the ratio of the virus load in the pre-processed material and the virus load in the post-processed material that is ready for use in the next step of the process. If the following abbreviations are used:

출발물질:
부피 v′; 역가 10^a′;
바이러스 부하량: (v′)(10^a′), 최종 물질:
부피 v″; 역가 10^a″;
바이러스 부하량: (v″)(10^a″), 개별 감소지수 R_i는 다음 식에 따라 계산한다.

Starting material:
Vol v’; titre 10^a’;
Virus load: (v’)(10^a’), Final material:
Vol v”; titre 10^a”;
Virus load: (v”)(10^a”), The individual reduction factors R_i are calculated according to

이 식은 공정 단계 전후 물질의 역가와 부피를 모두 고려한다.

This formula takes into account both the titres and volumes of the materials before and after the process step.

일부 바이러스 역가 측정에 내재된 부정확성 때문에, 전체 감소지수 계산에 사용되는 개별 감소지수는 1보다 커야 한다.

Because of the inherent imprecision of some virus titrations, an individual reduction factor used for the calculation of an overall reduction factor should be greater than 1.

전체 생산 공정에 대한 전체 감소지수는 개별 단계 감소지수의 로그값의 합이다. 이는 첫 번째 공정 제거 단계 시작 시점의 바이러스 부하량과 마지막 공정 제거 단계 종료 시점의 바이러스 부하량의 비에 대한 로그값을 나타낸다. 감소지수는 통상 로그 척도로 표시하는데, 이는 잔류 바이러스 감염성이 결코 0으로 감소하지는 않지만 수학적으로는 크게 감소할 수 있음을 의미한다.

The overall reduction factor for a complete production process is the sum logarithm of the reduction factors of the individual steps. It represents the logarithm of the ratio of the virus load at the beginning of the first process clearance step and at the end of the last process clearance step. Reduction factors are normally expressed on a logarithmic scale, which implies that, although residual virus infectivity will never be reduced to zero, it may be greatly reduced mathematically.

이 부록은 내재성 레트로바이러스와 같이 초기 수를 추정할 수 있는 바이러스에 적용된다.

This Annex is applicable to those viruses, such as endogenous retroviruses, for which an estimate of starting numbers can be made.

예:

Example:

따라서 백만 회 투여량당 1개 미만의 입자가 예상된다.

Therefore, less than one particle per million doses would be expected.

위의 사례는 설치류 세포로부터 단클론항체(mAb) 또는 그 밖의 재조합 단백질을 제조하는 동안 내재성 레트로바이러스가 감소하는 전형적인 경우(사례 B)이다. 특정 바이러스에 대한 종합적인 위해성 평가에서는 바이러스의 숙주 범위, 바이러스의 감염성과 병원성, 오염 방지 조치, 시험, 투여 경로, 사람 감염량 등 추가 요인을 고려하여야 한다.

The case above is typical for the reduction of endogenous retroviruses during the manufacture of mAbs or other recombinant proteins from rodent cells (Case B). In a comprehensive risk assessment for a specific virus, additional factors should be considered, such as the host range of the virus, the infectivity and pathogenicity of the virus, measures to avoid contamination, testing, the route of administration, and the human infectious dose.

CHO 세포에 대한 사례 B 시나리오에서는, 내재성 레트로바이러스가 비감염성으로 광범위하게 특성분석되었으므로, 시험에서 감염성 레트로바이러스의 존재가 확인되지 않는 경우 mAb 또는 그 밖의 재조합 단백질에 대하여 레트로바이러스 유사입자는 <10⁻⁴ 입자/투여량의 값이 허용 가능한 것으로 간주된다.

In the Case B scenario for CHO cells, since endogenous retroviruses have been extensively characterised as non-infectious, a value of <10^-4 particles/dose is considered acceptable for retroviral-like particles for mAbs or other recombinant proteins if testing fails to identify the presence of infectious retroviruses.

플랫폼 밸리데이션 접근법의 일반 원칙에 따라, 동일 플랫폼의 여러 제품에 걸쳐 견고한 바이러스 제거가 입증되어야 하며 바이러스 제거 절차는 확립되고 잘 특성분석된 조건을 따라야 한다. 또한 사전 지식이 공정 중간체 조성에 대한 바이러스 제거의 견고성을 보여주지 않는 한, 공정 중간체의 조성이 바이러스 제거 시험에 사용된 중간체와 동등함을 보여야 한다.

According to the general principles for a platform validation approach, robust viral clearance should be demonstrated across products from the same platform and the procedure for viral clearance should follow established and well-characterised conditions. In addition, it should be shown that the composition of the process intermediate is comparable to the intermediates used in viral clearance studies unless prior knowledge indicates robustness of viral clearance with respect to process intermediate composition.

이러한 맥락에서, 제품별 공정 밸리데이션과 달리, 플랫폼 밸리데이션은 새로운 유사 제품에 대한 감소지수를 주장하기 위하여 다른 제품의 바이러스 제거에 관한 자사(신청자 소유 데이터) 경험을 포함한 사전 지식을 활용하는 것으로 정의된다. 일반적으로 자사 경험을 포함한 사전 지식에 근거한 신규 제품의 바이러스 제거 주장에는 이용 가능한 모든 관련 플랫폼 데이터에 대한 논의와 플랫폼 밸리데이션 접근법을 뒷받침하는 근거가 포함되어야 한다(6.6절 참조). 제품별 밸리데이션을 줄이는 데 사용되는 사전 지식 및 자사 데이터의 일부는 신규 제품 및 그 제조 공정을 다른 자사 제품, 관련 공정 조건 및 공정 중간체와 비교하는 형태로 제공될 수 있다.

In this context, as opposed to product-specific process validation, platform validation is defined as the use of prior knowledge including in-house (applicant-owned data) experience with viral clearance from other products, to claim a reduction factor for a new similar product. In general, viral clearance claims for a new product based on prior knowledge including in-house experience should include a discussion of all relevant platform data available and the rationale to support the platform validation approach (see Section 6.6). Part of the prior knowledge and in-house data used to reduce product-specific validation could be provided as a comparison of the new product and its manufacturing process with other in-house products, related process conditions, and process intermediates.

바이러스 제거 전용 공정 단계(예: 계면활성제에 의한 불활화, 저pH 처리 및 바이러스 여과에 의한 제거)는 플랫폼 밸리데이션 접근법에 적합하다.

Process steps dedicated to viral clearance (e.g., inactivation by detergent, low pH and removal by virus filtration) are suitable for a platform validation approach.

따라서 계면활성제 및 저pH 처리에 의한 이종친화성 생쥐 백혈병 바이러스(Xenotropic Murine Leukaemia Virus, XMLV)의 불활화와 바이러스 여과에 의한 바이러스 제거에 사전 지식을 적용하는 예를 아래에 제시한다.

Therefore, examples for application of prior knowledge to Xenotropic Murine Leukaemia Virus (XMLV) inactivation by detergent and incubation at low pH, as well as virus removal by virus filtration are given below.

이 예들은 플랫폼 밸리데이션 접근법을 어떻게 적용할 수 있는지를 제시하기 위한 예시 목적으로만 제공되는 것이며, 규제 제출을 위한 양식이나 유일한 근거로 사용되어서는 안 된다.

These examples are provided for illustrative purposes, only suggesting how the platform validation approach could be applied and should not be used as a template or the sole basis for a regulatory submission.

표 A-2부터 표 A-4는 업계 전반에 적용되는 광범위한 공정 조건에 대한 현재의 이해에 따라, 개별 공정 단계에 대한 공정 변수와 그 잠재적 중요도를 요약한 것이다. 공정 변수 및 중간체가 바이러스 제거에 미치는 실제 영향은 사전 지식과 자사 경험으로 평가하여야 한다.

Tables A-2 to A-4 summarise process parameters and their potential criticality for the individual process step according to the current understanding of a wide range of process conditions applied across industry. The actual effect of process parameters and intermediates on viral clearance should be assessed by prior knowledge and in-house experience.

공정 이해가 발전함에 따라, 향후 추가 공정 단계가 플랫폼 밸리데이션 대상으로 고려될 수 있다.

Based on evolving process understanding, further process steps may be considered for platform validation in the future.

작용 기전에 근거하여, 용매/계면활성제(SD) 시약 또는 계면활성제 단독의 계면활성제 농도는 중요한 공정 변수이다.

Based on the mechanism of action, detergent concentration of Solvent/Detergent (SD) reagents or detergent alone is an important process parameter.

또한 지질, 세포 잔사, 또는 소포제 같은 세포배양 배지 성분 등의 소수성 불순물은 바이러스 지질 외피를 가용화하는 계면활성제 또는 SD 혼합물에 부담을 줌으로써 바이러스 불활화에 영향을 미칠 수 있으므로 평가하여야 한다.

In addition, hydrophobic impurities such as lipids, cell debris, or components of cell culture media such as antifoaming agents can affect virus inactivation by challenging the detergent or SD mixture in solubilizing the virus lipid envelope and therefore should be assessed.

현재까지 바이러스와 특정 치료용 단백질 간의 상호작용이 계면활성제에 의한 불활화에 영향을 미친다는 징후는 없다. 응집체(예: 세포 잔사 또는 응집된 바이러스 입자)는 잠재적으로 바이러스 입자를 포획하여 계면활성제의 접근으로부터 보호할 수 있다. 따라서 제조 시에는 계면활성제 불활화 전에 공칭 기공 크기 ≤0.2 µm의 여과 단계를 포함하여 제품 중간체(예: 수확 세포배양액(Harvested Cell Culture Fluid, HCCF))에서 세포/세포 잔사를 청징하여야 한다.

There is, so far, no indication that the interaction between virus and a specific therapeutic protein affects inactivation by detergent. Aggregates (e.g., cell debris or aggregated virus particles) can potentially entrap and protect viral particles from detergent access. Therefore, at manufacture, the product intermediate (e.g., Harvested Cell Culture Fluid (HCCF)) should be clarified from cells/cellular debris including a filtration step of ≤0.2 µm nominal pore size before detergent inactivation.

다음 단락에서는 SD 또는 Triton X-100을 이용한 XMLV 불활화를 예로 들어 플랫폼 밸리데이션 접근법을 적용하는 방법을 설명한다. 이 접근법은 견고하고 효율적인 XMLV 불활화를 제공하는 것으로 확인된 대체 계면활성제에도 적용할 수 있다.

The following paragraph describes how to apply a platform validation approach to XMLV inactivation using SD or Triton X-100 as an example. The approach may also be applicable to alternate detergents shown to provide robust and efficient XMLV inactivation.

Triton X-100은 막 연구에서 지질 이중층을 가용화하는 데 흔히 사용되는 비이온성 계면활성제이다. 이는 바이러스 지질 외피를 가용화하여 바이러스를 비감염성으로 만듦으로써 외피 바이러스를 불활화한다. Triton X-100은 수년간 혈장 유래 제품의 제조 공정에서 바이러스 불활화에 널리 사용되어 왔으며, mAb의 플랫폼 정제 공정에서도 HCCF에 첨가하는 방식으로 널리 사용되어 왔다.

Triton X-100 is a non-ionic detergent commonly used in membrane research to solubilize lipid bilayers. It inactivates enveloped viruses by solubilizing the virus lipid envelope thus rendering the virus non-infectious. Triton X-100 has been widely used for viral inactivation in manufacturing processes of plasma derived products for many years as well as in platform purification processes for mAbs by addition to HCCF.

유럽화학물질청(European Chemicals Agency)은 환경 중 분해 산물의 호르몬 유사 활성 때문에 Triton X-100을 허가 대상 물질 목록(Annex XIV)에 포함하였다. 따라서 널리 사용되고 있음에도 불구하고 제약 업계는 대체 계면활성제를 검토하고 있다. 유사한 물리화학적 특성을 가진 다른 계면활성제가 상업적으로 이용 가능하며 효율적인 XMLV 불활화를 달성한다. Triton X-100에 의한 불활화는 잘 특성분석되어 있고 그 유효성에 관한 충분한 지식이 축적되어 있기 때문에 이 가이드라인에 예로 포함하였다.

The European Chemicals Agency included Triton X-100 in the Authorisation List (Annex XIV) because of the hormone-like activity of degradation compounds in the environment. Therefore, though widely used, the pharmaceutical industry is looking into alternate detergents. Other detergents with similar physicochemical properties are commercially available and achieve efficient XMLV inactivation. Inactivation by Triton X-100 is included as an example in this guideline, because it is well characterised and a critical mass of knowledge regarding its effectiveness exists.

Triton X-100은 비이온성이므로 그 유효성은 pH, 이온 강도 또는 HCCF 중 상대 이온의 성질에 민감하지 않을 것이다. 사전 경험에 따르면, HCCF의 전형적인 지질 및 총 단백질 함량 범위를 포괄하는 플랫폼 공정의 여러 제품에 걸쳐 0.2% Triton X‑100 농도, 15°C, 60분 처리 조건에서 HCCF 중 XMLV가 효과적으로 불활화되었다. 그러나 아래에 제시한 바와 같이, 제품별 실험을 생략하는 경우에는 효과적이고 신뢰성 있는 불활화를 보장하기 위하여 Triton X-100 농도 0.5%를 적용하는 것이 권장된다.

Because of the non-ionic nature of Triton X-100, its effectiveness should not be sensitive to pH, to ionic strength, or to the nature of the counter ions in HCCF. Prior experience indicates effective XMLV inactivation in HCCF at 0.2% Triton X‑100 concentration, at 15°C, and at 60-minute incubation across multiple products from platform processes covering a range of typical lipid and total protein content in HCCF. However, as indicated below, applying a Triton X-100 concentration of 0.5% is recommended to ensure effective and reliable inactivation when omitting product-specific experiments.

표 A-2는 Triton X-100 또는 SD 시약과 MLV를 예로 들어, 지질 외피 바이러스의 계면활성제 기반 불활화에 대한 공정 변수와 그 잠재적 중요도를 요약한 것이다.

Table A-2 summarises process parameters and their potential criticality for detergent–based inactivation of lipid-enveloped virus using Triton X-100 or SD-reagents and MLV as an example.

따라서 청징된 HCCF에 Triton X-100을 사용하는 것에 대한 현재의 공정 이해에 부합하게, ≥ 0.5% Triton X-100 농도로 ≥ 15°C에서 ≥ 60분간 처리하면 여러 세포배양 유래 제품에서 XMLV가 효과적으로 불활화된다. SD 시약을 사용하는 경우, 1% Triton X-100과 0.3% 트리-N-부틸인산(Tri-N-Butylphosphate)으로 ≥ 30분간 처리하거나, 1% 폴리소르베이트 80과 0.3% 트리-N-부틸인산으로 ≥ 23°C에서 ≥ 6시간 처리하면 레트로바이러스가 효과적으로 불활화된다. 현재의 공정 이해에 따르면, SD 처리 또는 Triton X-100 단독 처리에 의한 XMLV 불활화에 플랫폼 밸리데이션 접근법을 적용할 수 있다.

Thus, consistent with current process understanding for using Triton X-100 with clarified HCCF, at a concentration of ≥ 0.5% Triton X-100 for ≥ 60 minutes at ≥ 15°C effectively inactivates XMLV for multiple cell culture derived products. When using SD-reagents, treatment with 1% Triton X-100 and 0.3% Tri-N-Butylphosphate for ≥ 30 minutes or treatment with 1% polysorbate 80 and 0.3% Tri-N-Butylphosphate for ≥ 6 hours at ≥ 23°C effectively inactivates retroviruses. According to current process understanding, a platform validation approach may be applied for XMLV inactivation by SD-treatment or treatment with Triton X-100 alone.

저pH 처리는 바이러스 외피에 위치한 단백질을 변성시켜 세포에 대한 흡착 및 감염을 막음으로써 외피 바이러스를 불활화한다. 포획 크로마토그래피 제품 풀(pool)의 저pH 처리는 mAb 같은 세포배양 유래 제품의 제조 공정에서 레트로바이러스 불활화에 널리 사용되어 왔다.

Low pH treatment inactivates enveloped viruses by denaturing proteins located in the viral envelope, thus preventing the adsorption to and infection of cells. Low pH treatment of the capture chromatography product pool has been widely used for retrovirus inactivation in manufacturing processes of cell culture derived products such as mAbs.

불활화 효율은 pH로 측정되는 불활화 물질인 수소 이온의 농도, 처리 시간과 온도, 그리고 완충액 매트릭스에 따라 달라진다. 극단적으로 높은 이온 강도도 불활화 효율에 영향을 미칠 수 있다.

Inactivation efficiency depends on the concentration of hydrogen ions as the inactivating agent, measured as pH, incubation time and temperature, and buffer matrix. Extremely high ionic strength may affect inactivation efficiency as well.

표 A-3은 XMLV의 저pH 불활화에 대한 공정 변수와 그 잠재적 영향을 요약한 것이다.

Table A-3 summarises process parameters and their potential effect on low pH inactivation of XMLV.

현재의 공정 이해에 부합하게, ≤ 500 mmol/L 염화나트륨 농도에서 ≤ pH 3.6, ≥ 15°C로 ≥ 30분간 저pH 처리하면 XMLV가 효과적으로 불활화된다. 아세트산 완충액과 시트르산 완충액이 가장 흔히 사용되며 견고한 XMLV 불활화를 가능하게 한다.

Consistent with current process understanding, low pH treatment at ≤ pH 3.6, ≥ 15°C for ≥ 30 minutes at ≤ 500 mmol/L sodium chloride concentration is effectively inactivating XMLV. Acetate and citrate buffer are most commonly used and allow for robust XMLV inactivation.

현재의 공정 이해에 따르면, 저pH 처리에 의한 XMLV 불활화에 플랫폼 밸리데이션 접근법을 적용할 수 있다.

According to the current process understanding, a platform validation approach can be applied for XMLV inactivation by low pH treatment.

바이러스 여과의 주된 작용 기전은 크기 기반의 입자 제거이다. 일반적으로 제품 중간체의 부피 처리량, 필터 플러싱에 사용되는 완충액의 부피 처리량, 그리고 압력/유량 중단을 포함한 압력은 바이러스 여과에서 잠재적으로 중요한 변수이다.

The primary mechanism of action of virus filtration is size-based particle removal. In general, volumetric throughput of the product intermediate as well as the volumetric throughput of the buffer used for flushing filters and pressure including pressure/flow interruptions are potentially critical parameters in virus filtration.

바이러스 입자 크기가 필터 기공 크기 분포보다 훨씬 큰 경우에는 바이러스 입자와 제품 간의 잠재적 상호작용이 중요하지 않다. 그러나 바이러스 입자 크기와 기공 크기가 비슷한 경우에는 잠재적 상호작용이 바이러스 보유(retention)에 미치는 영향이 완전히 이해되어 있지 않다.

A potential interaction of virus particles with the product is not critical when the virus particle size is much larger than the distribution of filter pore size. However, when the virus particle size and pore size are similar, the influence of the potential interaction on virus retention is not fully understood.

이 절의 나머지 부분은 소형 및 대형 바이러스 보유 필터에 의한 대형 바이러스 제거를 주장하기 위하여, 다른 제품의 바이러스 여과에 관한 사전 지식과 자사 경험을 활용하는 데 초점을 맞춘다. 사전 지식은 대형 및 소형 바이러스 보유 필터 모두에 활용할 수 있으나, 이 절은 더 흔히 사용되는 소형 바이러스 보유 필터에 초점을 맞춘다.

The rest of this section focuses on using prior knowledge and in-house experience in virus filtration of other products to claim large virus removal by small and large virus-retentive filters. Prior knowledge can be used for both large and small virus-retentive filters, but this section focuses on small virus-retentive filters, as they are more commonly used.

소형 바이러스 보유 필터에 의한 효율적인 레트로바이러스 제거에 영향을 미치는 요인은 필터 유형(모델 및 특성), 유량 제어 또는 압력 제어 여과 방식, 접선 흐름 또는 전량(dead-end) 여과, 압력 중단 등 공정 변수의 변동과 관련하여 잘 이해되어 있다. 바이러스 제거의 예측 가능성과 견고성에 근거하여, 이 공정 단계는 플랫폼 밸리데이션 접근법에 적합한 것으로 간주된다.

Factors that affect efficient retrovirus removal by small virus retentive filters are well understood with respect to variation of process parameters such as filter type (model and characteristics), flow- or pressure-controlled filtration mode, tangential or dead-end flow filtration, and pressure interruptions. Based on predictability and robustness of virus removal this process step is considered suitable for a platform validation approach.

소형 바이러스 보유 필터를 이용한 바이러스 제거의 경우, 한 가지 방안은 더 큰 구형/정이십면체 바이러스 및 외피 바이러스에 파보바이러스 감소지수를 적용하여 더 큰 바이러스로 밸리데이션 시험을 수행할 필요를 없애는 것이다. 그러나 이 경우 파보바이러스 통과로 인하여 바이러스 제거 능력(예: 대형 바이러스 제거 능력)이 과소평가될 수 있다. 크기 기반의 작용 기전과 소형 바이러스 보유 필터에 의한 견고하고 완전한 레트로바이러스 제거에 관한 업계의 경험을 고려할 때, 회사는 파보바이러스 및 대형 바이러스 제거에 관한 자사 데이터를 활용하여 흔히 사용되는 소형 바이러스 보유 필터에 대한 플랫폼 대형 바이러스 제거 주장을 구축할 수 있다.

For virus removal using small virus retentive filters, one option is to apply parvovirus reduction factors for larger spherical/icosahedral viruses and enveloped viruses thus avoiding the need to perform validation studies with larger viruses. However, sometimes this could result in underestimating virus removal capacity (e.g., large virus removal capacity) as a result of parvovirus passage. Given the size-based mechanism of action, and industry’s experience of robust complete retrovirus removal with small virus retentive filters, companies could use their in-house data from parvovirus and large virus removal to build a platform large viral clearance claim for commonly used small virus retentive filters.

크기 기반 제거 기전에 따르면, 소형 바이러스 보유 필터를 통한 바이러스 통과의 이론적 위험은 대형 바이러스보다 소형 바이러스에서 더 높다.

According to the size-based removal mechanism, the theoretical risk of virus passage through a small virus retentive filter is higher for small viruses than for large viruses.

제조 조건을 반영한 압력/유량 중단, 부피 처리량 및 여과 후 플러싱 부피의 영향에 대한 철저한 이해가 갖추어져 있어야 한다. 낮은 압력/유량 또는 압력/유량 중단이 특정 바이러스 필터 유형에 제한적인 부정적 영향을 미칠 수 있음을 고려하여야 한다.

A thorough understanding of the effect of pressure/flow interruptions, as well as volume throughput and post-filtration flush volume reflecting manufacturing conditions should be in place. It should be considered that there may be a limited negative impact of low pressure/flow or pressure/flow interruptions on specific virus filter types.

다른 제품의 사전 지식과 자사 경험을 활용하여 파보바이러스 제거를 주장하는 경우, 최악 조건을 고려하여 파보바이러스를 이용한 제품별 확인 밸리데이션 시험을 최소 1회 수행하여야 한다(표 A-4 참조). 바이러스 보유 필터의 상표/모델은 바이러스 감소 및 공정 변수의 영향에 대한 그 견고성에 중요하므로 플랫폼 데이터를 설계할 때 고려하여야 한다.

If using prior knowledge and in-house experience from other products to claim parvovirus removal at least one confirmatory product-specific validation run using a parvovirus should be performed considering worst-case conditions (see Table A-4). The brand/model of virus retentive filter is important for virus reduction and its robustness with respect to the effect of process parameters and should be considered when designing platform data.

표 A-4는 소형 바이러스 보유 필터를 이용한 파보바이러스 보유에 대한 공정 변수와 그 잠재적 영향을 요약한 것이다.

Table A-4 summarises process parameters and their potential effect on parvovirus retention using small virus retentive filters.

생명공학의 발전으로, 사람 또는 동물(즉, 조류, 포유류 또는 곤충) 유래의 특성분석된 세포은행을 사용하여 제조되는 새로운 유형의 제품을 발현하는 새롭고 진보된 생산 플랫폼이 등장하였다. 부록 6의 적용 범위에는 헬퍼 바이러스 및 단백질 발현용 바이러스 벡터(이를 통칭하여 생산 바이러스라 한다)를 사용하여, 또는 안정적이거나 일시적으로 형질감염된 세포주로부터 생산할 수 있는 유전자 조작 바이러스 벡터 및 바이러스 벡터 유래 제품이 포함된다. 여기에 포함되는 제품은 제품의 물리화학적 특성에 근거하여 바이러스 제거(viral clearance)가 가능한 제품이다.

Advances in biotechnology have led to the emergence of new and advanced production platforms expressing new product types manufactured using characterised cell banks of human or animal origin (i.e., avian, mammalian, or insect). The scope of Annex 6 includes genetically engineered viral vectors and viral-vector derived products that can be produced using helper-virus and viral vectors for protein expression (collectively referred to as production viruses) or from stable or transient transfected cell lines. The products included here are those amenable to viral clearance based on the physicochemical properties of the product.

이러한 제품에는 배큘로바이러스/곤충세포를 사용하여 생산되는 단백질 서브유닛 및 바이러스 유사입자(virus-like particle, VLP), 나노입자 기반 단백질 백신, 그리고 아데노부속바이러스(adeno-associated virus, AAV)와 같은 바이러스 벡터 제품이 포함된다. 이러한 벡터는 생체내(in vivo) 또는 생체외(ex vivo)로 적용될 수 있다.

These products include protein subunits and VLPs that are produced using baculovirus/insect cells, nanoparticle-based protein vaccines, and viral vector products such as AAV. These vectors may be applied in vivo or ex vivo.

헬퍼 바이러스 비의존성 제품은 안정적이거나 일시적으로 형질감염된 세포주를 사용하거나, 재조합 단백질 또는 VLP 발현을 위한 바이러스 벡터(예: 재조합 배큘로바이러스)를 감염시켜 제조할 수 있다. 헬퍼 바이러스 의존성 제품은 제품의 발현 또는 바이러스 벡터의 복제를 가능하게 하기 위하여 헬퍼 바이러스를 필요로 한다(예: 단순포진 바이러스(herpes simplex virus) 또는 아데노바이러스(adenovirus)와 같은 바이러스를 필요로 하는 AAV).

Helper virus independent products can be manufactured using stable or transient transfected cell lines or by infection with a viral vector for expression of recombinant protein or VLP (e.g., recombinant baculovirus). Helper-virus dependent products require a helper virus to enable expression of the product or replication of the viral vector (e.g., AAVs that require a virus such as herpes simplex virus or adenovirus).

생물의약품의 잠재적인 바이러스 오염원은 본 가이드라인 본문 제2절에 기술되어 있다. 발현 시스템으로 인해 유입되는 위험 및 복제가능 바이러스에 의한 오염 가능성과 같은 추가적인 바이러스 오염 위험을 고려하는 것이 바람직하다. 제품 제조 중 외부 유래 오염 가능성을 평가할 때에는 세포기질의 외래성 바이러스에 대한 감수성을 신중하게 고려하는 것이 바람직하다. 특성분석이 잘 된 세포은행 및 바이러스 시드를 사용하면 바이러스 오염 위험을 줄일 수 있다. 생산 바이러스는 공정 유래 불순물로 간주한다.

The potential sources for virus contamination for a biopharmaceutical product are described in Section 2 of the main guidance. Additional viral contamination risks such as those introduced by the expression system and the potential for contamination with replication competent virus should be considered. The susceptibility of the cell substrate to adventitious viruses should be carefully considered when assessing the potential for extrinsic contamination during product manufacture. The use of well-characterised cell banks and virus seeds can reduce the risk of virus contamination. Production viruses are considered process-related impurities.

새로운 유형의 제품에 대한 바이러스 안전성 및 오염 관리는 원료 조달, 제조공정의 적절한 단계에서의 바이러스 시험, 그리고 제조공정에 의한 외래성 바이러스 및 생산 바이러스의 제거 및/또는 불활화로 이루어진 종합적인 프로그램을 적용함으로써 보증하는 것이 바람직하다. 바이러스 제거가 제한적인 경우, 바이러스 안전성은 원료 및 시약과 제조공정의 시험 및 관리에 중점을 두는 것이 바람직하다.

Viral safety and contamination controls of new product types should be assured through the application of a comprehensive program of material sourcing, virus testing at appropriate steps of the manufacturing process and removal and/or inactivation of adventitious viruses and production viruses by the manufacturing process. If viral clearance is limited, viral safety should focus on the testing and control of the raw materials and reagents and the manufacturing process.

따라서 제품의 바이러스 안전성을 입증하는 데에는 위험 기반 접근방식을 적용하는 것이 바람직하다.

Accordingly, a risk-based approach should be applied for demonstrating viral safety of the product.

전반적인 제품 안전성을 뒷받침하기 위하여 제조의 적절한 단계에서 내재성 바이러스와 외래성 바이러스 모두에 대한 광범위한 시험 및 특성분석을 수행하는 것이 바람직하다. 제품 유형 및 그와 관련된 위험 요인에 근거하여, 시험 체계는 제품 수명주기 전반에 걸쳐 적용하는 것이 바람직하다. 아래 표 A-5는 생산 중 여러 단계에서 수행하여야 할 시험의 개요를 제시한다. 바이러스 시드, 미정제 원액(unprocessed bulk)(수확물), 정제 원액/원료의약품에 적용되는 시험을 기술한다. 바이러스 벡터 생산에 사용되는 세포기질의 시험 및 특성분석 체계는 본 가이드라인 본문의 표 1을 참조하며, 이러한 제품 유형에 적용될 수 있는 추가 고려사항도 표 A-5에 제시한다.

Extensive testing and characterisation for both endogenous viruses and adventitious viruses should be performed at suitable stages of manufacturing to support the overall product safety. Based on the product type and its associated risk factors, the testing scheme should apply across the product lifecycle. Table A-5 below provides an outline of the tests to be performed at various stages during production. The tests applied for virus seeds, unprocessed bulk (harvest), and purified bulk/drug substance are described. The testing and characterisation schemes for the cell substrates used for viral vector production are referred to in Table 1 in the main guideline; additional considerations that may apply for these product types are also indicated in Table A-5.

생산세포가 생산공정 중에 생존할 수 없는 경우, 생체외 세포연령 한계 세포(LIVCA)는 형질감염되지 않은 세포에 적용한다.

In cases where the producer cells cannot survive the production process, LIVCA applies to untransfected cells.

시험의 유형과 범위는 세포기질 및 제조공정과 관련된 특정 위험 요인을 고려한 위해성 평가에 따라 달라진다. 고려하여야 할 요인에는 세포기질 및 바이러스 시드/벡터의 기원, 계대 이력 및 특성, 원료 및 시약의 출처와 생산, 사용된 세포배양 공정, 생산 바이러스의 사용 여부, 그리고 바이러스를 불활화 및/또는 제거하는 제조공정의 능력이 포함된다.

The type and extent of testing depends on a risk assessment considering the specific risk factors associated with the cell substrate and the manufacturing process. Factors that should be considered include the origin, passage history and characteristics of the cell substrate and viral seeds/vector, the source and production of the raw materials and reagents, and cell culture process used, the use of production viruses and the capacity of the manufacturing process to inactivate and/or remove viruses.

외래성 바이러스, 내재성 바이러스 및 잔류 생산 바이러스에 의한 오염 위험은 가능한 범위에서 본 가이드라인의 일반 원칙에 따라 완화하는 것이 바람직하다. AAV와 같은 일부 바이러스 벡터 제품은 바이러스 제거 단계를 적용할 수 있어 외래성 바이러스 및 생산 바이러스의 제거(불활화 또는 제거)를 보증할 수 있다.

The risk of contamination with adventitious viruses, endogenous viruses and residual production viruses should be mitigated following the general principles of this guideline to the extent possible. Some viral-vector products such as AAVs are amenable to viral clearance steps, assuring adventitious and production viral clearance (inactivation or removal).

바이러스 제거는 대표성이 있고 적격성 평가된 축소 모델(scale-down model)을 사용하여 평가하는 것이 바람직하다. 바이러스 벡터 및 바이러스 벡터 유래 제품의 물리화학적 특성에 따라 하류공정 내에서 바이러스 제거가 어떻게 적용될지가 결정된다. 바이러스 제거 시험에는 생산 바이러스 자체 또는 특이 "모델" 바이러스(예: 배큘로바이러스, 아데노바이러스, 헤르페스바이러스)와 외래성 바이러스 및 내재성 바이러스를 대표하는 "모델" 바이러스(표 A-1 참조)를 포함하는 것이 바람직하다. 표 4에 기술된 특이 및 비특이 "모델" 바이러스 선정에 관한 조치 계획은 제5절 및 제6절을 참조한다. 제조공정은 단백질 발현용 바이러스 벡터 또는 헬퍼 바이러스를 견고하게 제거할 수 있어야 한다.

The viral clearance should be evaluated using representative and qualified scale-down models. The physicochemical characteristics of the viral vector and the viral vector-derived product will determine how viral clearance will apply within the downstream process. Virus-clearance studies should include the production virus itself or a specific “model” virus (e.g., baculovirus, adenovirus, herpesvirus) and “model” viruses representative of adventitious and endogenous viruses (see Table A-1). Refer to sections 5 and 6 for an action plan for the selection of specific and non-specific “model” viruses described in Table 4. The manufacturing processes should have robust clearance of the viral vector for protein expression or helper virus.

비외피 바이러스 벡터의 경우와 같이 제품이 적합한 경우에는 계면활성제 또는 용매/계면활성제(S/D) 처리와 같은 일반적인 바이러스 불활화 단계가 적합할 수 있다. 또는 크기 배제에 근거하여 바이러스 제거가 가능한 경우, AAV 또는 나노입자 기반 백신과 같은 소형 바이러스 벡터에는 바이러스 여과가 더 적합할 수 있다. 크로마토그래피 단계는 바이러스 벡터와 표면 특성이 다른 바이러스에 대하여 바이러스 제거 효과를 제공할 수 있다. 적절한 경우, 생산공정의 관련 단계에 대한 바이러스 감소지수(reduction factor)를 결정하기 위하여 바이러스 제거 시험을 수행하는 것이 바람직하다. 그 예로는 배큘로바이러스/곤충세포를 사용하여 생산되고 정제가 가능하며 제조공정을 통해 바이러스 제거를 달성할 수 있는 서브유닛 단백질 및 VLP의 제조가 있다.

Common virus inactivation steps such as treatment with detergent or solvent/detergent may be suitable, when the product is compatible, such as for non-enveloped viral vectors. Alternatively, virus filtration may be more suitable for small viral vectors such as AAV or nanoparticle-based vaccines when virus removal can be based on the size exclusion. Chromatography steps can provide viral clearance for viruses with different surface properties from the viral vector. When appropriate, viral clearance studies should be performed to determine virus reduction factors for the relevant step(s) of the production process. Examples include manufacture of subunit proteins and VLPs that are produced using baculovirus/insect cells and which can be purified, and for which viral clearance can be achieved through the manufacturing process.

이러한 제품의 바이러스 안전성은 폐쇄형 공정, 시험 및 그 밖의 예방적 관리에도 의존할 수 있다(제2.2절, 제3절 및 제4절 참조). 생산 중 바이러스 제거 단계는 재조합 단백질과 동일한 수준의 견고성을 달성하지 못할 수 있으므로, 제품의 바이러스 안전성은 위해성 평가로 뒷받침하는 것이 바람직하다.

The viral safety of these products may also rely on closed processing, testing and other preventative controls (see Sections 2.2, 3, and 4). Viral clearance steps during production may not achieve the same robustness as for recombinant proteins, therefore viral safety of the products should be supported by a risk assessment.