이 가이던스는 이 주제에 관한 FDA의 현재 견해를 나타낸다. 이 가이던스는 누구에게도 어떠한 권리를 만들지 않으며, FDA나 일반 대중을 구속하지 않는다. 적용 법률과 규정의 요건을 충족한다면 다른 접근 방법을 사용할 수 있다. 다른 접근 방법을 논의하려면 표지에 적힌 이 가이던스 담당 FDA 직원에게 연락한다.

This guidance represents the current thinking of the Food and Drug Administration (FDA or Agency) on this topic. It does not establish any rights for any person and is not binding on FDA or the public. You can use an alternative approach if it satisfies the requirements of the applicable statutes and regulations. To discuss an alternative approach, contact the FDA staff responsible for this guidance as listed on the title page.

이 가이던스는 저분자량 헤파린(low molecular weight heparin, LMWH) 제품의 면역원성 관련 고려사항을 다루며, 2014년 4월 9일 공고된(79 FR 19621) 초안 가이던스 「Immunogenicity-Related Considerations for the Approval of Low Molecular Weight Heparin for NDAs and ANDAs」를 최종 확정한다. II항에는 배경 정보가 들어 있다. III항 A에는 LMWH의 제네릭의약품 허가신청(ANDA)에서 유효성분 동일성 요건을 충족하는 방법에 관한 권고가 들어 있으며, 이는 ANDA에서 면역원성 관련 고려사항을 다루는 데 도움이 된다.

This guidance discusses immunogenicity-related considerations for low molecular weight heparin (LMWH) products and finalizes the draft guidance titled Immunogenicity-Related Considerations for the Approval of Low Molecular Weight Heparin for NDAs and ANDAs that was published on April 9, 2014 (79 FR 19621). Section II includes background information. Section IIIA includes recommendations on meeting the requirement for active ingredient sameness for abbreviated new drug applications (ANDAs) for LMWHs, which helps to address immunogenicity-related considerations in the context of ANDAs.

III항 B에는 ANDA에서 불순물과 그 불순물이 면역원성에 미칠 수 있는 영향을 다루는 방법에 관한 권고가 들어 있다. III항 B에는 또한 LMWH 의약품 허가신청의 승인 전이나 후에 출발물질(Heparin Sodium, USP)이나 다른 구성 성분이 바뀌거나 LMWH 제조공정이 변경되는 경우, 신약 허가신청(NDA)과 NDA 변경신청(sNDA) 또는 ANDA 변경신청(sANDA)²에서 불순물에 관한 권고도 들어 있다.^3,4 원료의약품 등록자료(DMF) 보유자도 이 가이던스의 권고에 유의하고 DMF를 최신 상태로 유지하여야 한다. DMF 보유자는 변경 사항을 인용 승인된 신청자에게 통지하여야 한다.⁵

Section IIIB includes recommendations on addressing impurities and their potential effect on immunogenicity for ANDAs. Section IIIB also includes recommendations on impurities for new drug applications (NDAs) and supplemental NDAs (sNDAs) or supplemental ANDAs (sANDAs)² in instances where the source material (Heparin Sodium, USP) or another component is changed, or when there are alterations in the manufacturing process for the LMWH either before or after approval of the LMWH drug application.^3,4 Drug Master File (DMF) holders should also be mindful of the recommendations in this guidance and ensure DMFs are current. DMF holders must notify authorized applicants of changes.⁵

일반적으로 FDA 가이던스 문서는 법적 강제력이 있는 책임을 정하지 않는다. 대신 가이던스는 어떤 주제에 관한 FDA의 현재 견해를 설명하며, 구체적인 규제 또는 법적 요건을 인용한 경우가 아니면 권고로만 보아야 한다. FDA 가이던스에서 should라는 단어를 쓰는 것은 어떤 것을 제안하거나 권고한다는 뜻이며, 요구한다는 뜻은 아니다.

In general, FDA’s guidance documents do not establish legally enforceable responsibilities. Instead, guidances describe the Agency’s current thinking on a topic and should be viewed only as recommendations, unless specific regulatory or statutory requirements are cited. The use of the word should in Agency guidances means that something is suggested or recommended, but not required.

LMWH 제품은 혈전증(혈전)의 예방과 치료에 쓰이는 항응고제이다. 이 제품들은 항응고제인 헤파린을 해중합하여 만든다. 헤파린은 특정 동물 종에서 발견되는 복잡한 천연 다당류이며, 그 골격은 반복되는 이당류 구성 단위로 이루어져 있다.⁶ 헤파린이나 LMWH 제품으로 치료하면 치명적일 수 있는 이상사례인 헤파린 유발 혈소판감소증(heparin-induced thrombocytopenia, HIT)이 생길 수 있다. HIT는 환자가 케모카인인 혈소판 제4인자(PF4)와 복합체를 이룬 헤파린이나 LMWH에 대한 항체를 만들어, 혈소판의 비가역적 응집과 고갈(혈소판감소증)이 일어날 때 발생한다.

LMWH products are anticoagulants used for the prevention and treatment of thrombosis (blood clots). These products are produced by depolymerization of the anticoagulant heparin, a complex, naturally occurring polysaccharide found in certain animal species and whose backbone consists of repeating disaccharide building blocks.⁶ Treatment with heparin or LMWH products can be associated with a potentially fatal adverse event, heparin-induced thrombocytopenia (HIT). This occurs when the patient produces antibodies to heparin or LMWH in complex with the chemokine platelet factor (PF4), leading to irreversible aggregation and depletion of blood platelets (thrombocytopenia).

Lovenox(에녹사파린)와 헤파린나트륨으로 치료받은 환자의 HIT 위험은 각각 0.2 퍼센트⁷와 2 – 3 퍼센트로 추정되었다.⁸ LMWH의 HIT 발생률은 비교적 낮지만, HIT에는 심각할 수 있는 결과가 따른다. LMWH는 외래 환경에서 투여될 수 있으므로, 신청자가 면역원성 위험을 어떻게 평가하고 관리하는지 문서화하는 것이 특히 중요하다. LMWH 허가신청 심사에는 면역원성 관련 정보의 검토가 포함된다.

The risk of HIT in patients treated with Lovenox (enoxaparin) and heparin sodium has been estimated to be 0.2 percent⁷ and 2 – 3 percent, respectively.⁸ Although the rate of HIT is relatively low for LMWHs, there are potentially serious consequences associated with HIT. Because LMWHs can be administered in out-patient settings, it is particularly important that applicants document how the risk of immunogenicity is assessed and managed. The review of LMWH applications includes a review of the immunogenicity-related information.

일반적으로 최초 NDA로 승인되는 제품의 면역원성 위험은 임상시험으로 평가한다. NDA의 승인 후 출발물질 변경이나 제조 변경에 따른 면역원성 위험을 다루는 데에도 경우에 따라 임상시험을 이용한다.⁹ 이 가이던스는 처음에 임상시험으로 면역원성 위험을 평가한 뒤, 특정 변경(승인 후 변경 포함)이 제품의 면역원성 위험에 미치는 영향을 평가하는 데 사용할 수 있는 다른 접근 방법을 다룬다. LMWH의 제네릭 버전(즉, ANDA로 승인된 제품)이 면역원성을 포함하여 해당 오리지널 제품만큼 안전하고 유효해야 하는 것이 중요하므로, 이 가이던스는 LMWH ANDA에서 유효성분 동일성 요건을 충족하는 방법과, 불순물 및 그 불순물이 PF4와의 복합체 형성과 면역반응 유발에 미치는 영향을 다루는 방법에 관한 권고도 제시한다.

In general, clinical trials are used to assess the risk of immunogenicity for products approved under original NDAs. Clinical trials are also used in some cases to address the risk of immunogenicity following postapproval source-material or manufacturing changes for NDAs.⁹ This guidance discusses an alternative approach that can be used, once the risk of immunogenicity has been evaluated through clinical trials in the first instance, to assess the effect of certain changes (including postapproval changes) on the product’s immunogenicity risk. Because it is important that generic versions of LMWHs (i.e., products approved in ANDAs) are as safe and effective as their brand name counterparts, including immunogenicity, this guidance also provides recommendations on meeting the requirement for active ingredient sameness for ANDAs for LMWHs as well as addressing impurities and their effect on forming complexes with PF4 and eliciting an immune response.

ANDA나 sANDA의 대상 제품에서 관련 참조의약품은 참조의약품(RLD)이다. NDA나 sNDA의 대상 제품에서 관련 참조의약품은 승인 후 변경의 경우 승인된 LMWH 제품이고, 임상시험 완료 후 제조 변경이 이루어진 최초 NDA의 경우 임상시험에 사용한 제품이다.

For a product that is the subject of an ANDA or sANDA, the relevant reference product is the reference listed drug (RLD). For a product that is the subject of an NDA or sNDA, the relevant reference product in the case of postapproval changes is the approved LMWH product, or in the case of an original NDA for which manufacturing changes are made after completion of clinical trials, the product used in clinical trials.

이 가이던스의 적용 대상인 LMWH 제품¹⁰의 면역원성 위험은 세 가지 주요 핵심 요소, 즉 (1) 원료의약품(API)의 동일성(ANDA만 해당), (2) LMWH 제품과 케모카인 PF4의 결합 및 PF4와 형성하는 복합체의 크기와 전하에 영향을 줄 수 있는 제품 내 불순물(NDA/ANDA), (3) 면역계에 대한 제품(또는 제품이 PF4와 형성하는 복합체)의 인식, 흡수, 처리 또는 제시를 변화시킬 수 있는 제품 내 불순물(NDA/ANDA)을 다룸으로써 관련 참조의약품과 비교하여 적절히 특성분석할 수 있다. 사용하는 방법이 LMWH 제품의 변화에 민감하다면 방법은 달라질 수 있다.

The risk of immunogenicity for the LMWH products subject to this guidance¹⁰ can be adequately characterized in comparison to their relevant reference products by addressing three principal critical elements: (1) the sameness of the active pharmaceutical ingredient (API) (ANDAs only); (2) the impurities in the product that may impact on the association of the LMWH product with the chemokine PF4, as well as the size and charge of the complexes formed with PF4 (NDAs/ANDAs); and (3) the impurities in the product that could modify the detection, uptake, processing or presentation of the product (or the complexes it forms with PF4) to the immune system (NDAs/ANDAs). The methods used can vary provided the methods used are sensitive to changes in the LMWH product.

생체분석적 특성분석만으로는 면역원성 고려사항과 관련하여 이 세 가지 핵심 요소를 확인하기에 충분하지 않을 수 있으므로, LMWH 제품과 관련 참조의약품 사이의 차이를 검출하기 위해 면역계에 대한 시험관내 및/또는 생체내 시험을 함께 사용할 것을 권고한다. 위에서 설명한 주요 요소 중 어느 하나라도 LMWH 제품과 관련 참조의약품 사이에 차이가 있으면 면역반응 위험이 커졌을 수 있고 다른 시험(예: 임상시험)이 필요할 수 있음을 시사할 수 있다. 또한 과학과 기술이 발전함에 따라 LMWH 제품의 면역원성을 평가하는 데 사용할 수 있는 방법이 달라질 수 있다. 마찬가지로 FDA의 승인 고려사항도 이들 제품의 면역원성 위험 증가의 잠재적 원인에 대한 이해 향상 같은 과학적 지식의 확대에 따라 달라질 수 있다.

Because bioanalytical characterization may be insufficient to confirm these three critical elements as they relate to immunogenicity considerations, we also recommend using in vitro and/or in vivo studies of the immune system to detect differences in the LMWH product as compared to its relevant reference product. Differences in any of the principal elements described above between the LMWH product and its relevant reference product could suggest increased risk for immune responses and the need to perform other studies (e.g., clinical studies). Furthermore, as science and technology evolve, there may be different methods available for evaluating the immunogenicity of LMWH products. Similarly, the Agency's approval considerations may evolve based on greater scientific knowledge, such as a better understanding of potential causes of increased risk of immunogenicity of these products.

ANDA에서 면역원성 위험을 다루려면 유효성분의 동일성을 입증하는 것이 매우 중요하다.

A demonstration of the sameness of an active ingredient is critical to addressing the risk of immunogenicity in the context of ANDAs.

LMWH 제품과 관련 참조의약품에 들어 있는 유효성분 또는 API¹¹의 동일성 특성분석은 (1) 물리화학적 특성, (2) 헤파린 출발물질과 해중합 방식, (3) 이당류 구성 단위, 조각 지도(fragment mapping), 올리고당 분자종의 서열, (4) 생물학적·생화학적 시험, (5) 생체내 약력학 프로파일에 관한 동등성을 입증함으로써 확립할 수 있다.^12,13 아래에 설명하는 비교 접근 방법은 LMWH API의 불균일성을 특성분석하기에 충분한 것으로 확인되었다. 이 기준들은 제조 조건의 작은 변화에도 매우 민감하며, 관련 공정서 기준(예: 항Xa 활성, 항IIa 활성, 항Xa/항IIa)을 충족하는 것으로 확인된 LMWH 제품들 사이에서도 여러 특성¹⁴의 차이를 식별할 수 있다.

The characterization of sameness of the active ingredient or API¹¹ contained in the LMWH product and relevant reference product can be established by demonstrating equivalence with respect to the following: (1) physicochemical properties; (2) heparin source material and mode of depolymerization; (3) disaccharide building blocks, fragment mapping and sequence of oligosaccharide species; (4) biological and biochemical assay; and (5) in vivo pharmacodynamic profile.^12,13 The comparative approach we describe below has been shown to be sufficient to characterize the heterogeneity of the LMWH API. These criteria are highly sensitive to minor changes in manufacturing conditions and are able to identify differences in a number of attributes¹⁴ among LMWH products found to meet relevant compendial standards (e.g., anti-Xa activity, anti-IIa activity, and anti-Xa/anti-IIa).

동등성을 입증하기 위해 LMWH API에서 분자량이 서로 다른 올리고당의 상대적 존재비와 관련 참조의약품 API의 분자량 분포를 특성분석하여야 한다. 이러한 비교는 크기배제 크로마토그래피(SEC)와 함께, 흔히 사슬 매핑법(chain mapping method)이라 부르는 방법^15,16을 사용하여 수행할 수 있으며, 사슬 매핑법은 올리고당 분자량의 지문 프로파일에 관한 보완 정보를 더 높은 분해능으로 제공한다.

You should characterize the relative abundance of oligosaccharides of different molecular weights in the LMWH API and the molecular weight distribution of the relevant reference product API to demonstrate equivalence. Such a comparison can be achieved by size exclusion chromatography (SEC), in conjunction with the method commonly referred to as the chain mapping method,^15,16 that provides complementary information on a fingerprint profile of oligosaccharide molecular weights at a higher resolution.

분자량 외에도, LMWH 올리고당의 전체 화학적 조성을 분석하여 그 주요 특징의 동등성을 입증하여야 한다. 이러한 분석에는 우론산 구조의 에피머화 상태(즉, 이두론산 대 글루쿠론산)와 올리고당 사슬 비환원 말단의 변형 구조 같은 특징적 구조에 대한 핵자기공명(NMR) 분석, 에녹사파린의 ∆4,5-우로네이트 구조 같은 고유 작용기의 존재를 보여 주는 자외선(UV) 비흡광도, 그리고 일부 USP 시험(예: ¹³C NMR 스펙트럼, 나트륨 함량, 황산기 대 카르복실기의 비)이 포함되어야 한다.¹⁷

In addition to molecular weight, you should demonstrate equivalence for key features of the LMWH oligosaccharides by analyzing their overall chemical composition. These analyses should include nuclear magnetic resonance (NMR) analysis of characteristic structures, such as the epimerization state of the uronic acid structure (i.e., iduronic versus glucuronic acid) and the modified structures at the non-reducing end of the oligosaccharide chains, ultraviolet (UV) specific absorbance that demonstrates the presence of unique functional groups such as the ∆4,5-uronate structure of enoxaparin, and certain USP tests (e.g., ¹³C NMR spectra, sodium content, and the ratio of sulfate to carboxylate).¹⁷

LMWH API의 서열 분포는 모체 헤파린에 자연적으로 존재하는 서열과 다당류 사슬에서 절단 반응이 일어나는 부위 둘 다에 따라 정해진다. 절단된 올리고당 사슬의 말단에 도입되는 화학 구조는, 헤파린 다당류 사슬을 LMWH API 올리고당 사슬로 해중합하는 절단 반응의 결과이다. 헤파린 안의 이당류 구성 단위 서열의 다양성은 헤파린의 생합성 경로에서 비롯되므로, 동등한 헤파린 출발물질과 동등한 해중합 방법을 사용하면 LMWH API가 올리고당 사슬 내 이당류 단위의 천연 서열 분포와 올리고당 사슬 말단의 변형 이당류 구성 단위의 다양성 모두에서 적어도 유사할 것으로 예상된다. 따라서 동등한 헤파린 출발물질(즉, 돼지 장 점막에서 유래하고 헤파린나트륨 USP 모노그래프 기준을 충족하는 헤파린)을 사용하여야 한다.

The distribution of sequences of LMWH API is a function of both the sequences found naturally in the parent heparin and the site(s) where the cleavage reaction occurs in the polysaccharide chain. Chemical structures introduced at the terminal ends of the cleaved oligosaccharide chains are a result of the cleavage reaction by which the heparin polysaccharide chains are depolymerized into the LMWH API oligosaccharide chains. Because the diversity of disaccharide building block sequences within heparin results from its biosynthetic pathway, the use of equivalent heparin source material and equivalent methods of depolymerization is expected to ensure that LMWH API will be at least similar with respect to both the distribution of natural sequences of disaccharide units in the oligosaccharide chains and the diversity of the modified disaccharide building blocks at the terminal ends of the oligosaccharide chains. Therefore, you should use equivalent heparin source material (i.e., heparin derived from porcine intestinal mucosa and that meets USP monograph standards for heparin sodium).

해중합 방식을 동등하게 하려면, 관련 참조의약품 제조에 사용한 것과 같은 해중합 화학(예: 에녹사파린의 경우 헤파린 벤질 에스테르 유도체의 알칼리 β-제거)을 사용하여 헤파린 다당류를 절단하여야 한다.

For equivalent mode of depolymerization, you should utilize the same depolymerization chemistry (e.g., alkaline β-elimination of the benzyl ester derivative of heparin for enoxaparin) to cleave the heparin polysaccharides, as used to manufacture the relevant reference product.

LMWH API와 관련 참조의약품 API 사이에서 이당류 구성 단위¹⁸의 변형을 포함하여 그 확인(identity)과 정량적 함량의 동등성을 입증하여야 한다. 이는 정제된 분해 효소(예: 헤파리나아제 I, II, III) 및/또는 화학 시약(예: 아질산)으로 LMWH API를 완전 분해하여 LMWH API를 구성하는 이당류 구성 단위를 얻음으로써 수행할 수 있다. 그런 다음 이 이당류 구성 단위를 모세관 전기영동(CE), 역상 고성능 액체크로마토그래피(RP-HPLC), 강음이온교환 고성능 액체크로마토그래피(SAX-HPLC) 같은 다양한 분석 방법으로 분리하고 정량할 수 있다.^19,20,21

You should demonstrate equivalence in the identity and quantitative levels of the disaccharide building blocks,¹⁸ including their modifications, between the LMWH API and its relevant reference product API. This can be achieved by exhaustive digestion of the LMWH API with purified digesting enzymes (e.g., heparinases I, II, and III) and/or chemical reagents (e.g., nitrous acid) to yield the disaccharide building blocks comprising the LMWH API. These disaccharide building blocks can then be separated and quantified by a variety of analytical approaches, such as capillary electrophoresis (CE), reversed-phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) and strong anion exchange high performance liquid chromatography (SAX-HPLC).^19,20,21

이 이당류 구성 단위의 확인은 문헌에서 구조가 규명된 이당류 구성 단위와의 비교, 질량분석(MS), NMR 분광법, 및/또는 변형 시약(예: 수소화붕소나트륨, 아질산)이나 변형 효소(예: 2-O-설파타아제, 6-O-설파타아제, ∆4,5-글리쿠로니다아제)를 이용한 분석 같은 화학적 접근 방법을 포함하되 이에 한정되지 않는 여러 기법을 조합하여 수행할 수 있다.^22,23,24,25

The identification of these disaccharide building blocks can be achieved by using a combination of several techniques, including (but not limited to) comparison to structurally assigned disaccharide building blocks in the literature, mass spectroscopy (MS), NMR spectroscopy, and/or chemical approaches such as analysis with modifying reagents (e.g., sodium borohydride and nitrous acid) or modifying enzymes (e.g., 2-O-sulphatase, 6-O-sulphatase, and ∆4,5-glycuronidase).^22,23,24,25

LMWH API와 관련 참조의약품 API 사이에서 분해된 올리고당의 조각 지도(LMWH 안에서 반복되는 올리고당 서열의 고유 특징을 나타낸다)의 동등성을 입증하여야 한다. 이는 구조 특이적으로 절단하는 효소 시약(예: 헤파리나아제 I)으로 부분 분해한 뒤, 민감한 분석 방법(예: RP-HPLC 또는 SAX-HPLC)으로 정성·정량 분석하여 수행할 수 있다.^26,27

You should demonstrate equivalence in the fragment map of digested oligosaccharides (representing the signature of recurring oligosaccharide sequences within the LMWH) between the LMWH API and its relevant reference product API. This can be achieved by partial digestion using enzymatic reagents that cleave in a structurally specific fashion (e.g., heparinase I), followed by a qualitative and quantitative analysis using sensitive analytical methods (e.g., RP-HPLC or SAX-HPLC).^26,27

LMWH API에 있는 올리고당 일부의 서열을 분석하고, 그 서열이 관련 참조의약품 API에 있는 서열과 동등함을 입증하여야 한다. LMWH API 올리고당의 직접 서열 분석은 크기 및/또는 전하 분리로 혼합물에서 특정 올리고당 분자종을 분리한 다음, 고분해능 분석 기법(예: 속성 부호화 명명법(property-encoded nomenclature, PEN)에 기반한 접근 방법과 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 질량분석(MALDI-MS)의 병용, 형광 표지 올리고당의 반복적 화학·효소 분해와 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 분석의 병용, 및/또는 효소 분해와 NMR 분광법의 병용)으로 그 서열을 분석하여 수행할 수 있다.^28,29,30,31

You should analyze sequences of a subset of oligosaccharides in the LMWH API and demonstrate their equivalence to those present in the relevant reference product API. The direct sequencing of oligosaccharides from the LMWH API can be done by isolating particular oligosaccharide species from the mixture through size and/or charge separation, and then analyzing their sequence using high-resolution analytical techniques (e.g., approaches based on property-encoded nomenclature (PEN) in conjunction with matrix-assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry (MALDI-MS), iterative chemical and enzymatic digestion of fluorescent tagged oligosaccharides in conjunction with analysis by polyacrylamide gel electrophoresis, and/or enzymatic digestion in conjunction with NMR spectroscopy).^28,29,30,31

이 부분의 평가에서는 LMWH API의 모든 올리고당 서열을 분석할 필요는 없으며, 공정 조건의 변화를 민감하게 측정할 수 있는 짧은 올리고당의 서열 분석에 초점을 맞추어야 한다.³²

In this part of the evaluation, it is not necessary to sequence all oligosaccharides in the LMWH API; the focus should be on sequencing short oligosaccharides that provide a sensitive measure of changes in process conditions.³²

활성화 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT)과 Heptest 연장 시간 같은 항응고 활성의 관련 지표에 대한 시험관내 생물학적 시험에서 LMWH API가 관련 참조의약품 API와 동등함을 입증하여야 한다. 생화학적 시험에 관한 동등성 기준을 충족하려면, LMWH API가 Xa 인자 억제(항Xa)와 IIa 인자 억제(항IIa) 면에서 관련 참조의약품 API와 동등함을 입증하여야 한다.

You should demonstrate that the LMWH API is equivalent to its relevant reference product API with respect to in vitro biological assays for relevant markers of anticoagulant activity, such as the activated partial thromboplastin time (aPTT) and the Heptest prolongation time. To meet the criterion of equivalence with respect to biochemical assays, you should demonstrate that the LMWH API is equivalent to its relevant reference product API in terms of factor Xa inhibition (anti-Xa) and factor IIa inhibition (anti-IIa).

생체내 혈장 항Xa 및 항IIa 활성 측정값을 바탕으로 생체내 약력학 프로파일의 동등성을 입증하여야 한다. 이를 위해 에녹사파린과 달테파린에 관한 FDA 개별 의약품 생물학적 동등성 가이던스에 설명된 대로, 건강한 피험자를 대상으로 공복, 단회 투여, 2원 교차 생체내 시험을 수행하여야 한다.^33,34

You should demonstrate equivalence in the in vivo pharmacodynamic profiles based upon measurements of in vivo plasma anti-Xa and anti-IIa activities. For this purpose, you should conduct a fasting, single-dose, two-way crossover in vivo study in normal subjects as described in FDA’s individual drug product bioequivalence guidance for enoxaparin and dalteparin.^33,34

헤파린 유발 혈소판감소증(HIT)은 LMWH-PF4 복합체에 대한 항체가 매개한다. LMWH와 관련된 주된 면역원성 위험 요인은 유효성분과 PF4의 상호작용으로 생각되며, 불순물이 있으면 LMWH와 PF4의 상호작용에 영향을 줄 수 있다. 따라서 LMWH와 PF4의 결합, 그리고 정해진 조건에서 형성되는 LMWH-PF4 복합체의 크기와 전하를 평가하여 관련 참조의약품의 결과와 비교하여야 한다.

Heparin-induced thrombocytopenia (HIT) is mediated by antibodies to the LMWH-PF4 complex. The primary immunogenicity risk factor associated with LMWHs is thought to involve the interaction of the active ingredient with PF4 and the presence of impurities may affect the interaction of the LMWH with PF4. Therefore, the association of the LMWH with PF4, as well as the size and charge of the LMWH-PF4 complexes formed under specified conditions, should be assessed and compared to that of the relevant reference product.

LMWH가 PF4와 형성하는 복합체의 특성은 PF4 자체의 품질(예: 사량체 형성 능력)과 두 성분의 비율 및 농도에 영향을 받을 수 있다. 따라서 신청 LMWH와 PF4의 결합을 여러 비율과 농도에서 특성분석하여야 한다. 선택한 비율과 농도에는 초거대 복합체 형성으로 이어지는 조건을 포함하여, 문헌에서 면역원성이 있다고 이미 보고된 조건이 포함되어야 한다.³⁵ LMWH와 PF4의 결합을 평가하는 데 사용하는 방법(예: 전자현미경, 표면 플라즈몬 공명, 원편광 이색성)은 LMWH의 차이에 민감하여야 하며, 선택한 방법의 적합성을 뒷받침하는 개발 및 밸리데이션 자료를 허가신청에 제출하여야 한다.

The characteristics of the complexes formed by LMWH with PF4 could be affected by the quality of the PF4 itself (e.g., its ability to form tetramers) and the ratio and concentration of the two components. Therefore, the association of the proposed LMWH and PF4 should be characterized at different ratios and concentrations. The ratios and concentrations selected should encompass those previously described in the literature as being immunogenic, including those that lead to the formation of ultra large complexes.³⁵ The methods used to assess association of the LMWH with PF4 (e.g., electron microscopy, surface plasmon resonance or circular dichroism) should be sensitive to differences in the LMWH and the development and validation studies that support the suitability of the method(s) selected should be submitted to the application.

PF4와 LMWH 사이에 형성되는 여러 복합체의 크기와 전하는 두 성분의 비율과 농도에 따라 달라질 것으로 예상되므로, 각 농도 조합마다 형성되는 소형, 중간형, 초거대 복합체^36,37의 크기와 전하 및 상대 농도를 적합한 생체분석 방법으로 특성분석하여야 한다. 소형 복합체와 대형 복합체를 모두 정확하게 특성분석하려면 여러 방법이 필요할 수 있다. 적합한 방법의 예로는 SEC-UV 및 SEC-다각도 광산란 분석, 광자 상관 분광법, 분석용 초원심분리, 장 흐름 분획법(field flow fractionation), 원편광 이색성, 원자간력 현미경이 있다.

Because size and charge of the various complexes formed between PF4 and the LMWH are expected to change depending on the ratio and concentration of the two components, for each set of concentrations, the size and charge and relative concentrations of small, intermediate and ultra large complexes^36,37 formed should be characterized using suitable bioanalytical methods. Several methods may be needed to accurately characterize both small and large complexes. Examples of suitable methods include SEC-UV and SEC-multi-angle light scattering analysis, photon correlation spectroscopy, analytical ultracentrifugation, field flow fractionation, circular dichroism, and atomic force microscopy.

선택한 방법은 LMWH-PF4 복합체의 크기와 전하 차이를 식별하는 데 적합함이 입증되어야 하며, 선택한 방법의 적합성을 뒷받침하는 개발 및 밸리데이션 자료를 허가신청에 제출하여야 한다. 얻은 결과는 가능하면 언제나 직교 방법으로 확인하여야 한다.

The chosen method(s) should be shown to be suitable for identifying differences in the size and charge of the LMWH-PF4 complexes, and the development and validation studies that support the suitability of the method(s) selected should be submitted to the application. The results obtained should be confirmed using an orthogonal method, whenever possible.

LMWH 안의 불순물은 제품의 변화를 촉매하거나, 선천면역 작용제로 작용하거나, LMWH와 PF4의 상호작용을 바꿈으로써 제품의 면역원성을 높일 수 있다. 불순물은 공정 유래 불순물일 수도 있고 제품 유래 불순물일 수도 있다. 불순물은 구조가 알려졌거나, 부분적으로 특성분석되었거나, 확인되지 않은 것일 수 있다.³⁸ 면역계에 대한 LMWH 또는 LMWH가 PF4와 형성하는 복합체의 인식, 흡수, 처리 또는 제시를 변화시킬 가능성이 있는, LMWH에 존재하는 불순물(예: 잔류 단백질, 핵산, 지질)을 특성분석하여야 한다. 시험을 통해 LMWH에 이러한 불순물이 없거나, 관련 참조의약품과 비슷한 수준과 품질로 이러한 물질을 함유함을 입증하여야 한다.

Impurities in a LMWH can foster product immunogenicity by catalyzing changes in the product, acting as innate immune agonists, or changing the interaction of the LMWH with PF4. Impurities may be either process- or product-related. They can be of known structure, partially characterized, or unidentified.³⁸ You should characterize impurities (e.g., residual proteins, nucleic acids, and lipids) present in the LMWH that could potentially modify the detection, uptake, processing, or presentation of the LMWH, or the complexes it forms with PF4, to the immune system. Studies should demonstrate that the LMWH is free of such impurities or contains similar levels and quality of such substances as its relevant reference product.

FDA는 다양한 적합한 생체분석 방법을 사용하여 불순물을 다루는 상호 보완적인 세 가지 접근 방법, 즉 (1) LMWH와 비분획 헤파린 출발물질 및 기타 원자재에서 불순물(예: 단백질, 지질, 핵산)의 존재를 시험하는 것,³⁹ (2) 제조공정의 잠재적 불순물 제거 능력을 평가하는 것, (3) 관련 참조의약품과 비교하여 LMWH 내 제품 불순물의 양과 성질을 특성분석하는 것을 권고한다. 선택한 방법은 불순물을 식별하는 데 적합함이 입증되어야 하며, 선택한 방법의 적합성을 뒷받침하는 개발 및 밸리데이션 자료를 허가신청에 제출하여야 한다.

FDA recommends three complementary approaches using a variety of suitable bioanalytical methods to address impurities: (1) testing the LMWH, as well as the unfractionated heparin source material and other raw materials for the presence of impurities (e.g., proteins, lipids, and nucleic acids);³⁹ (2) assessing the capacity of the manufacturing process to remove potential impurities; and (3) characterizing the amount and nature of product impurities in the LMWH relative to those in its relevant reference product. The chosen method(s) should be shown to be suitable for identifying impurities and the development and validation studies supporting the suitability of the method(s) selected should be submitted to the application.

또한 LMWH 제품의 유효기간 동안 용기마개 시스템에서 나오는 추출물 및 침출물에 관한 정보를 제공하여야 한다.

In addition, information should be provided on extractables and leachables from the container closure system over the shelf life of the LMWH product.

면역계는 현재의 분석 방법으로 놓치는 제품 불순물과 유효성분의 작은 변화를 검출하는 효과적인 도구가 될 수 있다. 시험관내 및/또는 생체내 모델을 사용하여 면역 활성화의 여러 지표를 평가하고 LMWH와 관련 참조의약품이 유발하는 면역반응을 특성분석하면, LMWH가 관련 참조의약품보다 더 큰 면역반응을 일으킬 가능성을 평가하도록 설계된 다른 생체분석 기법을 보완할 수 있다. 선택한 방법은 제품 불순물과 LMWH의 변화를 검출하는 데 적합함이 입증되어야 하며, 선택한 방법의 적합성을 뒷받침하는 개발 및 밸리데이션 자료를 허가신청에 제출하여야 한다.

The immune system can be an effective tool to detect small changes in product impurities and active ingredients that are missed by current analytical methods. Assessment of multiple parameters of immune activation and characterization of the immune response elicited by the LMWH and its relevant reference product using in vitro and/or in vivo models may complement other bioanalytical techniques designed to assess the potential of the LMWH to generate greater immune responses as compared to its relevant reference product. The chosen method(s) should be shown to be suitable for detecting changes in product impurities and the LMWH and the development and validation studies that support the suitability of the method(s) selected should be submitted to the application.

관련 참조의약품과 비교하는 실험에 사용한 LMWH의 각 로트에 대해, 문서에는 식별 명칭, 제조일자와 제조소, 제조공정(둘 이상인 경우), 용기마개 시스템, 출하 시험 및 안정성시험 결과가 포함되어야 한다. 로트 선정의 근거를 제공하여야 한다. 또한 LMWH의 갓 제조한 로트, 유효기간 중간 로트, 유효기간 만료 임박 로트를 각각 여러 개, 그리고 관련 참조의약품의 비슷한 단계의 로트에 관한 데이터를 FDA에 제공할 것을 권고한다.

For each lot of the LMWH used in the experiments in comparison to the relevant reference product, the documentation should include the identification name, date, and site of manufacture; manufacturing process (if more than one exists); container closure system; and results from the release and stability testing. The rationale for the selection of lots should be provided. We also recommend that you provide to FDA data on multiple freshly manufactured, mid-expiry-cycle, and close-to-expiry product lots for the LMWH, and similar-stage lots of the relevant reference product.