이 초안 가이던스는 최종화되면 이 주제에 관한 FDA(FDA 또는 Agency)의 현재 견해를 나타낼 것이다. 이 가이던스는 누구에게도 어떠한 권리를 만들지 않으며, FDA나 일반 대중을 구속하지 않는다. 적용 법률과 규정의 요건을 충족한다면 다른 접근 방법을 사용할 수 있다. 다른 접근 방법을 논의하려면 표지에 적힌 이 가이던스 담당 FDA 직원에게 연락한다.

This draft guidance, when finalized, will represent the current thinking of the Food and Drug Administration (FDA or Agency) on this topic. It does not establish any rights for any person and is not binding on FDA or the public. You can use an alternative approach if it satisfies the requirements of the applicable statutes and regulations. To discuss an alternative approach, contact the FDA staff responsible for this guidance as listed on the title page.

이 가이던스는 임상시험용 사람 유전체 편집(GE) 제품의 임상시험 개시를 뒷받침하기 위해 필요할 가능성이 높은 비임상시험에 사용되는 차세대 염기서열 분석(NGS) 기반 방법에 관한 권고사항을 제공한다.² 이 권고사항은 2024년 1월자 「Guidance for Industry: Human Gene Therapy Products Incorporating Human Genome Editing」(2024년 1월 GE 가이던스)(Ref. 1)에서 논의한 비임상·임상·CMC 고려사항에 더하여 적용된다. 사람 GE 제품의 임상 개발 프로그램은 유전자치료제 자체와 관련된 위험과 함께, 개별화 치료제를 포함한 유전질환 표적 치료제의 표적 외 편집 및 의도하지 않은 유전체 변화를 포함하여 GE와 관련된 추가적인 위험도 다루어야 한다.

This guidance provides recommendations for next-generation sequencing (NGS)-based methods used in nonclinical studies that will likely be needed to support initiation of clinical trials of investigational human genome editing (GE) products.² These recommendations are in addition to the nonclinical, clinical, and CMC considerations discussed in the “Guidance for Industry: Human Gene Therapy Products Incorporating Human Genome Editing” dated January 2024 (January 2024 GE Guidance) (Ref. 1). Clinical development programs of human GE products should address both the risks associated with the gene therapy product itself as well as the additional risks associated with GE, including off-target editing and unintended changes to the genome for therapies targeting genetic diseases, including individualized therapies.

임상시험 설계 고려사항과 사람 GE 제품의 유익성 및 위험을 가늠하는 FDA의 과학 기반 접근 방법에 관한 더 많은 정보는 2024년 1월 GE 가이던스(Ref. 1)를 참고한다. 이 가이던스의 권고사항은 임상시험계획(IND) 및 생물의약품 허가신청(BLA)을 뒷받침하기 위해 제출되는 사람 GE 제품의 표적 외 편집 및 유전체 완전성 상실과 관련된 잠재적 안전성 위험을 평가하기 위해 NGS 방법과 생물정보학을 사용하는 비임상시험을 설계하는 데 이해관계자에게 지침이 될 수 있다.

For more information on clinical study design considerations and our science-based approach weighing the benefits and risks for human GE products, please refer to the January 2024 GE Guidance (Ref. 1). The recommendations in this guidance may guide stakeholders on designing nonclinical studies that use NGS methods and bioinformatics to evaluate the potential safety risks associated with off-target editing and loss of genome integrity in human GE products submitted in support of Investigational New Drug (IND) applications and Biologics License Applications (BLAs).

일반적으로 이 가이던스를 포함한 FDA의 가이던스 문서는 법적으로 집행 가능한 책임을 설정하지 않는다. 대신 가이던스는 어떤 주제에 관한 FDA의 현재 견해를 설명하며, 특정 규정상 또는 법률상 요건이 인용되지 않은 경우에는 권고사항으로만 보아야 한다. FDA 가이던스에서 should라는 단어를 사용한 것은 어떤 것이 제안되거나 권고되지만 요구되는 것은 아님을 뜻한다.

In general, FDA’s guidance documents, including this guidance, do not establish legally enforceable responsibilities. Instead, guidances describe the FDA’s current thinking on a topic and should be viewed only as recommendations, unless specific regulatory or statutory requirements are cited. The use of the word should in FDA’s guidances means that something is suggested or recommended, but not required.

GE 도구 또는 편집기(editor)는 유전체, 후성유전체 또는 전사체의 특정(즉, 의도된 표적) 부위에서 편집을 수행하도록 설계되어 사용되어 왔다. 여러 유전체 편집 도구가 사용하는 서로 다른 서열 인식 과정과 상이한 작용기전으로 인해 많은 GE 방식(modality)이 생겨났다. 예를 들어 균일 간격 짧은 회문구조 반복서열(CRISPR) 연관(Cas) 시스템은 가이드 RNA(gRNA)를 사용하여 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 서열이 존재하는 조건에서 상보적 서열을 가진 특정 유전체 부위를 표적으로 하여 편집한다. 이 시스템은 서로 다른 PAM 서열 요구조건과 뉴클레오타이드 편집 능력을 가진 다양한 Cas 단백질이 발견되면서 크게 다양해졌다.

GE tools or editors have been designed and used to perform editing at a specific (i.e., intended on-target) site(s) in either the genome, the epigenome, or the transcriptome. The distinct sequence recognition process and different mechanisms of action used by various genome editing tools have given rise to many GE modalities. For instance, the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated (Cas) system uses a guide RNA (gRNA) to target a specific genomic site harboring the complementary sequence in the presence of a protospacer adjacent motif (PAM) sequence for editing. This system has greatly diversified with the discovery of a wide range of Cas proteins with distinct PAM sequence requirements and nucleotide editing capabilities.

또한 Cas 단백질을 디아미네이스, 역전사효소, DNA 메틸트랜스퍼레이스와 같은 여러 종류의 작용 분자와 융합함으로써 이미 확장되고 있던 GE 도구 모음에 다양성이 더해졌다. CRISPR-Cas와 달리 메가뉴클레아제, 징크핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사활성인자 유사 작용 뉴클레아제(TALEN)와 같은 다른 방식은 특정 DNA 서열을 인식하는 단백질 도메인을 사용한다. 연구 노력이 계속되면서 GE 분야는 더 새롭고 프로그래밍 가능하며 특이적인 편집 방식의 발견으로 계속 확장될 가능성이 높다.

Furthermore, fusion of Cas proteins with different types of effector molecules such as deaminases, reverse transcriptase, or DNA methyltransferase has added versatility to an already expanding GE toolbox. In contrast to the CRISPR-Cas, other modalities such as meganuclease, zinc finger nuclease (ZFN), and transcription activator-like effector nucleases (TALENs) use protein domains that recognize specific DNA sequence(s). With continued research efforts, the GE field will likely continue to expand with the discovery of newer, programmable, and specific editing modalities.

의뢰자는 세포를 생체외 또는 생체내로 편집하기 위해 매우 다양한 GE 방식을 사용해 왔다. 구체적으로 GE 방식은 환자(자가) 또는 건강한 공여자(동종)로부터 얻은 세포를 사용하여 세포를 생체외로 편집하는 데 사용될 수 있다. 또는 편집기를 암호화하는 전령 RNA(mRNA)를 사용하거나 프로모터 하에서 발현되는 편집기 암호화 서열을 가진 DNA 기반 벡터를 사용하여 세포를 생체내로 편집할 수 있다. 그러나 어느 경우에도 표적 외(즉, 의도하지 않은) 부위에서의 GE 및/또는 염색체 전위는 그러한 편집이 정상 세포 기능에 유해할 수 있으므로 잠재적인 안전성 위험이 된다. 따라서 표적 세포 또는 조직의 의도하지 않은 변화를 최소화하기 위하여 사람 GE 제품의 표적 외 편집 위험과 염색체 완전성에 대한 영향을 평가하는 적절한 평가가 매우 중요하다.

Sponsors have used a wide variety of GE modalities to edit cells ex vivo or in vivo. Specifically, GE modalities can be used to edit cells ex vivo using cells obtained from either patients (autologous) or healthy donors (allogeneic). Alternatively, cells can be edited in vivo using messenger RNA (mRNA) encoding the editor or using DNA-based vectors harboring the editor coding sequence that is expressed under a promoter. However, in either case, GE at off-target (i.e., unintended) site(s) and/or chromosomal translocations are a potential safety risk since such edits could be deleterious to normal cell function. Therefore, an adequate assessment to evaluate off-target editing risk and impact on chromosomal integrity of human GE products is crucial to minimize unintended changes in the target cells or tissues.

표적 외 편집 시험은 광범위한 GE 제품에서 표적 외 편집 활성을 평가하기 위해 계산적 방법 및/또는 NGS 기반 방법을 사용한다. 이 가이던스는 표적 외 편집 활성을 평가하는 NGS 기반 시험, NGS 기반 염색체 완전성 평가 시험, 표적 편집 부위 평가, 염기서열 분석 방법, 검체 선정 고려사항, FDA에 대한 결과 보고에 관한 FDA의 권고사항을 제공한다.

Off-target editing studies use computational and/or NGS-based methods to assess off-target editing activity in a wide range of GE products. This guidance provides FDA’s recommendations pertaining to NGS-based studies assessing off-target editing activity, NGS-based chromosomal integrity assessment studies, on-target edit site assessments, sequencing methods, considerations for sample selection, and reporting the findings to FDA.

이 가이던스는 유전체 편집 기술이 적용된 사람 유전자치료제³를 개발하는 의뢰자를 대상으로 한다. 2024년 1월 GE 가이던스는 사람 GE를 사람 체세포 유전체의 특정 위치에서 DNA 서열을 추가, 삭제, 변경 또는 치환하는 공정으로 설명한다(Ref. 1). 그러나 GE 분야의 빠른 연구 속도로 인해 후성유전체를 변경하거나 RNA 서열을 절단할 수도 있는 GE 기술이 개발되었다. 이 가이던스에서 사람 GE 제품은 후성유전체 또는 전사체를 편집하는 제품도 포함하며, 표적 외 편집 활성의 NGS 기반 평가에 대한 권고사항은 이러한 모든 제품에 적용된다.

This guidance is intended for sponsors developing human gene therapy drug products³ involving genome editing technologies. The January 2024 GE Guidance describes human GE as a process by which DNA sequences are added, deleted, altered or replaced at specific location(s) in the genome of human somatic cells (Ref. 1). However, the rapid pace of research in the GE field has led to the development of GE technologies that can also modify the epigenome or cleave RNA sequences. For the purpose of this guidance, human GE products also include products editing the epigenome or the transcriptome, and recommendations made for NGS-based evaluation of off-target editing activity would be applicable to all of these products.

의뢰자는 자사 의약품의 표적 외 편집 위험을 평가하기 위해 NGS 기반 방법과 생물정보학 도구를 통상적으로 사용한다. 이 가이던스는 DNA 편집기, 후성유전 편집기, RNA를 절단하는 편집기와 같은 광범위한 GE 방식에 대하여 표적 외 편집 위험과 염색체 완전성에 대한 영향을 평가하기 위해 NGS와 생물정보학을 사용하는 비임상시험에 관한 권고사항을 제공한다.

Sponsors routinely use NGS-based methods and bioinformatics tools to assess off-target editing risk of their drug product(s). This guidance provides recommendations for nonclinical studies using NGS and bioinformatics to assess off-target editing risk and impact on chromosomal integrity for a broad range of GE modalities such as DNA editors, epigenetic editors, and editors that cleave RNA.

NGS 기술과 생물정보학 도구는 일반적으로 특정 유전체 위치를 평가하는 표적 방법을 사용하거나 유전체 전체를 평가하는 유전체 전장 방법을 사용하여 민감하고 정량적인 평가를 가능하게 한다. 구체적으로 이러한 방법에는 표적 염기서열 분석을 수행하거나, 유전체 편집기가 가하는 표적 외 편집 활성의 결과일 수 있는 의도하지 않은 변화를 탐색하기 위해 유전체 전장 염기서열 분석 방법을 사용하는 것이 포함될 수 있다. 이 항에서 FDA는 표적 외 편집 부위 평가와 GE 세포에서 의도된/표적 유전체 변화의 평가를 위한 NGS 사용에 관한 구체적인 권고사항을 제공한다.

The NGS technology and bioinformatics tools generally allow for sensitive and quantitative assessment using targeted methods to assess specific genomic locations or using genome-wide methods to assess the genome. Specifically, these methods may include performing targeted sequencing or using genome-wide sequencing methods to scan for unintentional changes that may be a consequence of an off-target editing activity imparted by a genome editor. In this section, we provide specific recommendations on the use of NGS for off-target edit site assessments and for the evaluation of intended/on-target genomic changes in GE cells.

의뢰자는 적용하려는 표적 및 표적 외 편집 부위 분석 방법의 목적에 부합하는 적절한 염기서열 분석 전략을 사용하여야 한다. 예를 들어 짧은 구간의 DNA(예: 50-bp 이하)에 변화를 초래하는 표적 및 표적 외 부위에서의 편집을 평가하는 경우에는 짧은 리드(short-read) 염기서열 분석 기반 방법을 활용하는 염기서열 분석 전략이 적절할 수 있다.⁴ 그러나 큰 삽입 또는 큰 결실의 존재를 확인하기 위해 더 긴 서열 구간을 평가하는 경우에는 그러한 변화를 검출할 수 있는 긴 리드(long-read) 염기서열 분석 기반 방법을 사용하는 염기서열 분석 전략을 적용하여야 할 수 있다.^{5, 6}

Sponsors should use an appropriate sequencing strategy that meets the goals of the on-target and off-target edit site analysis method being implemented. For example, for assessing editing at on- and off-target sites that result in changes to a short stretch of DNA (e.g., ≤50-bp), a sequencing strategy utilizing short-read sequencing-based methods may be adequate.⁴ However, evaluation of longer stretches of sequence for the presence of large insertions or large deletions may require implementing a sequencing strategy that uses long-read sequencing-based methods that can detect such changes.^{5, 6}

염기서열 분석은 적절한 양의 투입 물질(해당되는 경우 유전체 DNA, 세포 수 또는 RNA)을 사용하여, 통상적으로 표적 편집률보다 낮은 빈도 또는 편집률로 발생하는 잠재적인 표적 외 편집 사건을 검출할 수 있는 깊이로 수행하여야 한다. 의뢰자는 염기서열 분석 깊이의 적절성과 민감도를 뒷받침하고 저빈도 표적 외 편집 사건을 검출하기 위한 전략을 뒷받침하기 위하여, 엔지니어링 NGS 실행의 대표 자료와 같은 자체 생성 자료 및/또는 동료심사 문헌의 관련 정보를 제출하여야 한다. 해당되는 경우 PCR 증폭 편향 및/또는 프라이머 편향을 최소화하는 전략이 권장된다. NGS 및 자료 분석에 관한 상세한 보고서에는 다음이 포함되어야 한다.

Sequencing should be performed using an adequate amount of the input material (genomic DNA, cell number, or RNA, as applicable) at a depth that allows detection of potential off-target editing events occurring at frequencies or edit rates that are usually lower than the on-target edit rate. Sponsors should provide data generated in-house, such as representative data from engineering NGS runs, and/or relevant information from peer-reviewed publications, to support the adequacy and the sensitivity of sequencing depth and to support their strategy to detect low frequency off-target editing events. Where applicable, strategies to minimize PCR amplification bias and/or primer bias are recommended. A detailed report of the NGS and data analysis should include the following:

표적 부위란 편집기에 의한 편집이 의도된 유전체 또는 전사체 내의 특정 서열이다. 표적 편집률은 표적 부위의 염기서열을 분석하고 표적 부위를 포괄하는 총 리드 중 의도된 편집을 가진 리드의 비율을 평가하여 결정할 수 있다. 의뢰자는 표적 편집률을 편집된 리드의 비율 또는 백분율로 보고하여야 한다. 표적 및 표적 외 부위 분석에 사용하는 검체는 그 결과로 나타나는 표적 편집률이 최종 의약품에서 제안된 비율과 비교 가능하도록 적절한 변수로 편집되어야 한다. 의도된 표적 편집률을 달성하면 검체에 유전체 편집기 활성의 최적 수준이 존재함을 보장할 가능성이 높다. 의뢰자는 시험관내 시험에서 얻은 표적 편집률을 보고하여야 하며, 그 자료를 표적 외 편집 활성을 평가하는 시험법의 적절성을 뒷받침하는 데 사용할 수 있다(가능한 경우).

An on-target site is a specific sequence in the genome or transcriptome that is intended for editing by the editor. The on-target editing rate can be determined by sequencing the on-target site and evaluating the proportion of reads harboring the intended edit over total reads covering the target site. The sponsor should report the on-target edit rate either as a ratio or percentage of edited reads. Samples used for on- and off-target site analysis should be edited with appropriate parameter(s) so that the resulting on-target editing rates are comparable to the rates proposed in the final drug product. Achieving the intended rate of on-target editing likely ensures the presence of the optimal level of genome editor activity in the samples. The sponsor should report the on-target editing rates from the in vitro studies and may use the data to support the adequacy of assays evaluating off-target editing activity (as feasible).

또한 의뢰자는 적절한 검체에서 표적 유전체 편집 부위의 의도된 편집과 의도하지 않은 편집의 비율을 모두 측정하고 보고하기 위해 적절한 염기서열 분석 기반 방법을 사용하여야 한다(검체 선정에 관한 권고사항은 VI.A항 참조). 표적 편집 프로파일링에 사용하는 염기서열 분석 전략과 검체에 관한 구체적인 권고사항은 아래에 제시한다.

Additionally, the sponsor should use appropriate sequencing-based methods to measure and report the rates of both intended and unintended edits at the on-target genomic edit site(s) in appropriate samples (see section VI.A for recommendations on sample selection). Specific recommendations for sequencing strategy and samples used for on-target edit profiling are provided below.

의뢰자는 표적 유전체 위치에서 의도된 편집의 비율을 측정할 수 있는 표적 염기서열 분석 전략을 사용하여야 한다. 편집 방식이 단일 뉴클레오타이드(예: 단일 염기쌍을 치환, 결실 또는 삽입하는 유전체 편집) 또는 짧은 구간의 뉴클레오타이드(예: 짧은 구간의 뉴클레오타이드 삽입 또는 결실을 초래하는 유전체 편집)에 변화를 가하는 경우에는 표적 편집 부위를 평가하기 위해 짧은 리드 또는 긴 리드 염기서열 분석 기반 방법이 권장된다. 그러나 편집 방식이 이중가닥 절단을 일으키거나 큰 구간의 DNA(50bp를 초과하여 수 킬로염기쌍에 이르는 삽입 또는 결실)에 의도하지 않은 변화를 유발할 수 있는 경우에는 긴 리드 염기서열 분석 기반 방법을 사용한 표적 편집 부위 분석을 수행하여야 한다.

Sponsors should use a targeted sequencing strategy that enables the measurement of the rate of intended edits at on-target genomic location(s). Short-read or long-read sequencing-based method(s) are recommended to assess the on-target edit site if the editing modality imparts changes to a single nucleotide (e.g., a genome edit replacing, deleting or inserting a single base pair) or a short stretch of nucleotides (e.g., a genome edit resulting in insertion or deletion of a short stretch of nucleotides). However, on-target edit site analysis using long-read sequencing-based methods should be performed if the editing modality creates double strand breaks and/or has the capacity to cause unintentional changes to a large stretch of DNA (insertions or deletions that are >50bp to several kilobase pair long).

의뢰자는 표적 편집 부위 분석에 사용한 염기서열 분석 방법의 적절성을 뒷받침하는 타당성 근거를 제출하여야 한다.

The sponsor should provide justification to support the adequacy of their sequencing method used for on-target edit site analysis.

해당되는 경우 의뢰자는 적절한 염기서열 분석 깊이와 편향을 줄이기 위한 적절한 전략을 사용하여야 하며(NGS 고려사항에 관한 정보는 IV항 참조), 의도된 편집 결과의 비율보다 낮은 빈도로 발생할 수 있는 의도하지 않은 편집 결과의 검출을 가능하게 하여야 한다. 표적 편집 부위 분석 자료는 확인된 모든 편집 사건(치환 및/또는 삽입 및/또는 결실)의 목록과 염기서열 분석 자료에서 결정된 관련 편집 빈도(편집률)를 표로 정리하여 제출할 수 있다.

Where applicable, sponsors should use adequate sequencing depth and appropriate strategies to reduce bias (see section IV for information on NGS considerations) and to facilitate the detection of unintended edit outcomes potentially occurring at lower frequency than the intended edit outcome rate. The data from on-target edit site analysis may be provided as a list of all the editing events (substitutions, and/or insertions, and/or deletions) identified and the associated frequencies of edits (edit rates) determined from the sequencing data in a tabulated form.

적절하게 설계된 표적 편집 부위 프로파일링 전략에는 생체외 GE 제품에서 편집되는 세포와 동일한 세포 검체를 사용하거나, 생체내 유전체 편집 제품의 의도된 작용 부위에 있는 세포 유형을 대표하는 세포 검체를 사용하는 것이 포함될 수 있다(검체 선정에 관한 추가 권고사항은 VI.A항 참조).

An appropriately designed on-target edit site profiling strategy may include using cell samples that are identical to the cells edited in an ex vivo GE product or that are representative of the cell type at the intended site of action for an in vivo genome editing product (see section VI.A for additional recommendation on sample selection).

DNA 편집기와 후성유전 편집기의 경우 표적 외 편집 부위란 편집 활성이 관찰되었으나 의도되지 않았던 유전체 내의 모든 서열이다. 마찬가지로 RNA 편집기의 경우 표적 외 편집 부위란 표적 외 편집 사건이 유전자 발현에 의도하지 않은 변화를 초래하게 되는 전사체 내의 모든 서열이다. 이러한 표적 외 편집 부위는 편집하려고 제안된 표적 편집 부위와 비교할 때 어느 정도의 상동성 또는 유사성을 가진다.

For DNA editors and epigenetic editors, an off-target edit site is any sequence in the genome where editing activity was observed but was not intended. Similarly, for RNA editors, an off-target edit site is any sequence in the transcriptome where an off-target editing event would result in an unintended change to gene expression. These off-target edit sites harbor some degree of homology or similarity when compared to the on-target edit site that is proposed for editing.

이 항은 표적 외 편집 부위 지명(nomination)⁸, 표적 외 편집 부위 확인⁹, 표적 외 분석 변수에 사용되는 접근 방법에 관한 권고사항을 제공한다. 구체적으로 이 항은 검체 선정, 표적 외 편집 부위 지명을 위한 방식별 방법 또는 일반적으로 적용 가능한 방법의 사용, 시험을 기술할 때 포함되어야 하는 구체적인 정보, 시험 결과의 보고에 관한 추가 권고사항을 제공한다.

This section provides recommendations for approaches used for off-target edit site nomination⁸, off-target edit site confirmation⁹, and off-target analysis parameters. Specifically, this section provides additional recommendations on sample selection, using modality-specific or generally applicable methods for off-target edit site nomination, specific information that should be included when describing the studies, and reporting of the study results.

표적 외 편집 활성을 평가하는 시험법의 재현성과 민감도를 높이기 위하여, FDA는 의뢰자가 적절한 NGS 방법을 사용하고(NGS 고려사항은 IV항 참조), 표적 부위에서 의도된 편집률을 달성하는 적절한 검체를 사용하며(검체 고려사항은 VI.A항 참조, 표적 편집 부위 평가는 V항 참조), 생물학적 반복 시료를 사용할 것을 권고한다.

To facilitate reproducibility and sensitivity of assays evaluating off-target editing activity, we recommend that the sponsor use appropriate NGS method(s) (see section IV for NGS considerations) and use appropriate samples (see section VI.A for sample considerations) that achieve the intended editing rate at on-target site(s) (see section V for on-target edit site assessment), and use biological replicates.

표적 외 편집 부위 지명 및 확인 시험은 여러 개의 생물학적 반복 시료로 수행하여야 한다. 환자 또는 건강한 공여자로부터 얻은 사람 세포의 사용이 권장된다. 일차 사람 세포 검체를 얻는 것이 가능하지 않다면 의뢰자는 대표적인 불멸화 사람 세포주의 사용을 고려하고, 해당 시험에 선정한 검체의 적절성을 뒷받침하는 과학적 타당성 근거를 자료와 함께(해당되는 경우) 제출할 수 있다. FDA는 의뢰자가 생체외 또는 생체내로 편집하려는 표적 세포 유형을 대표하는 세포를 사용할 것을 권고한다. 검체 선정은 편집 방식(생체내 또는 생체외), 검체 확보 가능성, 시험관내 배양 조건에 대한 세포의 적합성과 같은 요인의 영향도 받는다.

Off-target edit site nomination and confirmatory testing studies should be performed in multiple biological replicates. Use of human cells that are either from patients, or from healthy donors is recommended. If obtaining primary human cell samples is not feasible, then a sponsor may consider using representative immortalized human cell lines and provide scientific justification with data (as applicable) to support the adequacy of sample(s) selected for the study. We recommend that sponsors use cells that are representative of the target cell type that they intend to edit either ex vivo or in vivo. The sample selection is further impacted by factors such as the mode of editing (in vivo or ex vivo), sample availability, and the amenability of cells to in vitro culture conditions.

생체외 GE 제품의 표적 외 편집 활성을 평가하는 시험은 의약품 제조를 위해 편집되는 세포 유형과 동일한 세포 유형을 사용하여 수행하여야 한다. 또한 표적 외 위험을 평가하는 데 사용하는 검체는 최종 의약품에서 관찰된 비율과 비교 가능한 표적 편집률을 가져야 한다. GE 전략이 환자 세포의 돌연변이를 교정하는 것을 목표로 한다면, FDA는 의뢰자가 환자 유래 검체 또는 해당 돌연변이를 갖도록 조작된 정상 세포를 사용할 것을 권고한다. 이러한 접근 방법은 표적 부위에서의 편집률 보고를 용이하게 한다. 의뢰자는 적절한 경우 건강한 공여자 검체를 사용하고 그 접근 방법의 적절성을 뒷받침하는 과학적 타당성 근거를 제출할 수 있다.

Studies assessing off-target editing activity in ex vivo GE products should be performed using a cell type that is identical to the cell type being edited for drug product generation. Additionally, the samples used to assess off-target risk should have on-target editing rates that are comparable to the rates observed in the final drug product. If the GE strategy is aimed at correcting a mutation in patient cells, then we recommend that sponsors use patient-derived samples or normal cells that are engineered to harbor the mutation. This approach will facilitate reporting of editing rates at the on-target site. The sponsor may use healthy donor samples where appropriate and provide scientific justification to support the adequacy of the approach.

의뢰자가 편집하려는 세포 유형과 다른 세포 유형을 선택하는 경우에는 검체 선정 전략의 적절성을 뒷받침하는 과학적 타당성 근거를 제출하여야 한다.

If the sponsor chooses a cell type that is different from the cell type they intend to edit, they should provide scientific justification to support the adequacy of their sample selection strategy.

생체내 제품의 표적 외 편집 활성 평가에 대하여 FDA는 의뢰자가 생체내에서 의약품의 의도된 표적 조직을 대표하는 적절한 세포 유형을 사용하고, 표적 부위에서 의도된 수준의 편집률을 가져오는 편집 변수를 사용할 것을 권고한다. 그러나 적절한 세포 유형을 확보할 수 없거나 얻기 어려운 경우, 또는 그 세포가 시험관내 시험에 적합하지 않은 경우에는, 의뢰자는 표적 외 편집 활성을 평가하는 시험을 수행하기 위해 대체 방법 또는 대체 세포 검체의 사용을 고려하고 그 전략을 뒷받침하는 과학적 타당성 근거를 제출할 수 있다. 예를 들어 의뢰자는 표적 외 편집 부위 지명을 위해 유전체 DNA 물질이 필요한 생화학적 시험법을 사용할 수 있다.

For the assessment of off-target editing activity of in vivo products, we recommend that sponsors use appropriate cell types that are representative of the drug product’s intended target tissue in vivo and use editing parameters that results in the intended level of editing rates at the on-target site. However, if appropriate cell type(s) are unavailable, difficult to obtain, or if the cells are not amenable to in vitro studies, then sponsors may consider using alternative methods or cell samples to perform studies assessing off-target editing activity and provide scientific justification to support their strategy. For example, the sponsor may use a biochemical assay(s) that requires genomic DNA material for off-target edit site nomination.

의도된 편집이 질병을 유발하는 돌연변이의 교정을 목표로 한다면, 건강한 공여자 검체를 사용하는 것으로는 표적 편집률을 평가할 수 없다. 그러한 경우에는 표적 외 편집 활성의 평가를 위해 환자 유래 세포 또는 표적 돌연변이를 갖도록 조작된 정상 세포를 사용하는 것이 권장된다. 표적 돌연변이를 가진 세포를 (질병의 중증도나 희소성, 환자 세포 확보 가능성 등으로 인해) 확보할 수 없어 사용할 수 없는 경우, 의뢰자는 건강한 공여자 검체의 사용을 고려하고 그 접근 방법의 적절성을 뒷받침하는 과학적 타당성 근거를 제출할 수 있다.

If an intended edit is aimed at correcting a disease-causing mutation, then the use of healthy donor samples would not allow for the evaluation of on-target editing rates. In such a case, using patient-derived cells or normal cells engineered to harbor the target mutation is recommended for the assessment of off-target editing activity. If cells harboring the target mutation cannot be used because such cells are unavailable, (due to disease severity or rarity, patient cell availability, etc.,) sponsors may consider using healthy donor samples and provide scientific justification to support the adequacy of the approach.

마지막으로, 2024년 1월 GE 가이던스(Ref. 1)에서 논의한 체내분포 시험 자료는 제품이 검출된 (비표적) 조직이나 장기를 대표하는 다른 세포 유형에서 추가적인 표적 부위 분석, 표적 외 편집 부위 지명, 표적 외 편집 부위 확인 분석을 수행할 필요성을 판단하는 근거가 되어야 한다.

Finally, the data from biodistribution studies, as discussed in the January 2024 GE Guidance (Ref. 1), should inform the need to conduct additional on-target site analysis, off-target edit site nomination, and off-target edit site confirmation analyses in other cell type(s) representative of (non-target) tissues or organs where the product was detected.

표적 외 편집 활성 평가를 위해 세포 기반 방법을 적용하는 경우, 생체내 의약품에 사용하는 것과 동일한 전달 방법(예: 지질나노입자(LNP), 아데노연관 바이러스 벡터(AAV), 전기천공 등)의 사용이 권장된다. 그러나 생체내 전달 방법이 시험관내 세포 시스템에 사용하기에 적합하지 않은 경우, 의뢰자는 GE 구성 요소를 전달하기 위한 대체 방법을 고려할 수 있다. 이러한 시험을 수행할 때 의뢰자는 편집기 발현 수준과 표적 편집률을 평가하고 그 자료를 시험 보고서에 제출하여야 한다. 의뢰자는 또한 해당되는 경우 시험에 사용한 검체 선정, 전달 방법, 편집 변수의 적절성을 뒷받침하는 과학적 타당성 근거를 제출하여야 한다.

When implementing cell-based methods for assessing off-target editing activity, use of a delivery method (e.g., lipid nanoparticle (LNP), adeno associated viral vectors (AAVs), electroporation, etc.) that is identical to the one used in the in vivo drug product is recommended. However, if the in vivo delivery method is not amenable for use in in vitro cell system(s), sponsors may consider alternative methods to deliver the GE components. When performing these studies, the sponsor should evaluate editor expression level, on-target editing rate(s), and submit the data in the study report(s). The sponsor should also provide scientific justification, as applicable, to support the adequacy of their sample selection, delivery method, and editing parameters used in the study.

2024년 1월 GE 가이던스(Ref. 1)는 표적 외 부위 지명을 위해 세포 기반 시험법, 생화학적 시험법, 인실리코(in silico) 방법과 같은 여러 접근 방법을 사용할 것을 권고한다. 세포 기반 시험법은 표적 외 분석을 위해 생체외에서 편집된 배양 세포의 유전체 DNA를 사용한다. 반면 생화학적 시험법은 표적 외 분석을 위해 시험관내에서 편집된 정제 유전체 DNA를 사용한다. 이후 유전체 DNA 분석에는 라이브러리 제작, NGS, 염기서열 분석 자료의 생물정보학 분석이 포함된다(NGS 고려사항은 IV항 참조).

The January 2024 GE Guidance (Ref. 1) recommends using multiple approaches such as cell-based assays, biochemical assays, and in silico methods for off-target site nomination. Cell-based assays use genomic DNA from ex vivo edited cultured cells for off-target analysis. Biochemical assays, on the other hand, use purified genomic DNA that are edited in vitro for off-target analysis. Subsequent analysis of the genomic DNA involves library preparation, NGS, and bioinformatics analysis of sequencing data (see section IV for NGS considerations).

세포 기반 시험법과 생화학적 시험법은 본래 유전체에 이중가닥 절단을 일으키는 유전체 편집기의 표적 외 편집 활성 평가를 위해 개발되었다. 그러나 유전체의 단일가닥 절단/닉(nick)을 검출하기 위해 이러한 시험법이 변경되거나 새로운 시험법이 개발되었다. 따라서 의뢰자는 제안하는 편집기의 작용기전을 고려하여 표적 외 편집 부위 지명을 위한 적절한 방법을 선택하여야 한다. 예를 들어 이중가닥 절단을 초래하는 표적 외 편집 활성을 검출하도록 설계된 시험법은 염기 편집기가 만든 단일가닥 닉을 검출하기에 적합하지 않을 수 있다. 그러한 경우 의뢰자는 염기서열 분석 후 편집 사건의 검출이 가능하도록 엔도뉴클레아제를 사용하여 단일가닥 닉 부위에 이중가닥 절단을 만드는, 적절하게 설계된 시험법을 고려할 수 있다.

Cell-based and biochemical assays were originally developed for assessment of off-target editing activity of genome editors that create double strand breaks in the genome. However, these assays have been modified, or new assays have been developed, to detect single strand breaks/nicks in the genome. Thus, sponsors should consider the mechanism of action of their proposed editor and choose an appropriate method for off-target edit site nomination. For example, assays designed to detect off-target editing activities resulting in double strand breaks may not be suitable to detect single strand nicks created by base editors. In such a case, sponsors may consider an appropriately designed assay using an endonuclease to create double strand breaks at single strand nick sites to enable detection of edit events post-sequencing.

의뢰자는 공개된 방식별 표적 외 편집 분석 접근 방법을 선택할 때 제안하는 편집기의 작용기전을 고려하여야 하며, 관련 동료심사 문헌을 인용하거나 자체 생성 자료를 제출하여 그 전략의 타당성을 입증하여야 한다. 공개된 전략에서 변경한 사항은 변경된 전략의 적절성을 입증하는 자체 생성 자료로 뒷받침되어야 한다. 시험법의 변경이란 의뢰자가 적용하였으나 이전 문헌에 기술되지 않은 시험법 설계상의 중대한 변경을 말한다. 표적 외 편집 활성을 평가하는 시험법에 도입된 중대한 변경을 뒷받침하기 위하여, 의뢰자는 제안한 중대한 변경이 시험법의 민감도에 영향을 주지 않았고 자료 품질을 손상시키지 않았으며 어떠한 편향도 도입하지 않았음을 뒷받침하는 추가 정보 또는 시험을 제출하여야 한다.

The sponsor should consider the mechanism of action of their proposed editor when selecting a published modality-specific off-target editing analysis approach and justify their strategy by referencing relevant peer reviewed publication(s) and/or by providing data generated in-house. Any change from the published strategy should be supported by data generated in-house demonstrating the adequacy of the modified strategy. A change in the assay may be any major modification to the assay design that was implemented by the sponsor but was not described in prior publication(s). To support any major modification(s) introduced in the assay evaluating off-target editing activity, the sponsor should provide additional information or studies to support that their proposed major modification(s) did not impact the sensitivity of the assay, impair the data quality, or introduce any bias(es).

새롭고 공개되지 않은 표적 외 분석 방법을 사용하는 경우, 의뢰자는 그 방법의 적절성과 민감도를 뒷받침하는 추가 정보를 제출하여야 한다. CRISPR-Cas 기반 제품의 경우, 예를 들어 새로운 방법을 적용한 후 확인된, 널리 연구된 gRNA의 표적 외 편집 부위를 보고하고 그 새로운 접근 방법의 적절성을 뒷받침하는 비교 평가를 제출함으로써 이를 달성할 수 있다. CRISPR-Cas 기반 방법을 사용하지 않는 편집 방식의 경우, 표적 외 편집 활성을 평가하는 시험법을 개발하는 데 유사한 접근 방법을 사용할 수 있으며, 양성 대조를 개발하여 사용함으로써 뒷받침할 수 있다.

When using a novel, unpublished off-target analysis method(s), the sponsor should provide additional information to support the adequacy and sensitivity of their method(s). For CRISPR-Cas-based products, this could be achieved, for example, through reporting off-target edit sites of widely-researched gRNAs identified after implementing the new method and then providing a comparative assessment to support the adequacy of the novel approach. For editing modalities that do not use CRISPR-Cas-based method(s), a similar approach may be used to develop assays evaluating off-target editing activity and may be supported by developing and using positive controls.

각 표적 외 편집 부위 지명 시험의 결과는 지명된 표적 외 부위의 목록을 표로 정리하여 제출하여야 한다(표적 외 편집 부위 보고에 관한 권고사항은 VI.F항 참조). 방식별 시험법에 관한 구체적인 권고사항은 VI.B.1항과 VI.B.2항에 제시한다.

The findings from each off-target edit site nomination study should be submitted as a list of nominated off-target sites in a tabulated form (see section VI.F for recommendations on reporting off-target edit sites). Specific recommendations for modality-specific assays are provided in sections VI.B.1 and VI.B.2.

특정 유형 또는 종류의 GE 방식의 안전성을 평가할 확립된 실험적 방법(생화학적 시험법 또는 세포 기반 시험법)이 없는 경우, 의뢰자는 표적 외 편집 부위를 지명하기 위해 폭넓게 적용 가능한 다른 방법의 적용을 고려할 수 있다. 이러한 접근 방법에는 계산 알고리즘을 사용하거나 확립된 NGS 기반 방법을 적용하는 것이 포함된다.

In the absence of established empirical methods (biochemical or cell-based assays) to assess the safety of a specific type or class of GE modality, the sponsor may consider implementing other broadly applicable methods to nominate off-target edit sites. These approaches include using computational algorithms or applying established NGS-based methods.

잠재적 표적 외 편집 부위의 수와 표적 외 편집 위험을 결정하는 주요 요인 중 하나는 gRNA 또는 표적 서열과 사람 유전체의 다른 영역 사이의 서열 상동성이다. 인실리코 또는 계산 알고리즘은 사용자가 참조 유전체를 탐색하여 사용자가 제공한 gRNA 서열과 상동성을 갖는 유전체 내 추가 영역을 확인할 수 있게 한다. 의뢰자는 인실리코 표적 외 편집 부위 지명 도구를 사용할 때 다음 사항을 고려하여야 한다.

One of the main determinants of the number of potential off-target edit sites and the off-target editing risk is sequence homology of the gRNA or the target sequence to other regions of the human genome. In silico or computational algorithms allow users to scan the reference genome and identify additional regions in the genome that harbor homology to the user-provided gRNA sequence. Sponsors should consider the following points when using in silico off-target edit site nomination tools:

현재의 NGS 기술은 유전체·전사체·후성유전체의 변화를 평가하거나 mRNA 양을 정량할 수 있게 한다. 의뢰자는 의약품에 사용되는 편집기의 작용기전에 따라 세포 내 의도된 편집을 평가할 수 있는 NGS 기반 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어 후성유전체 편집기를 사용하여 특정 유전체 부위의 사이토신 염기를 메틸화하려는 의약품의 표적 외 편집 위험은 NGS 기반 유전체 전역 DNA 메틸화 분석 방법으로 평가하여야 한다. 적절한 NGS 기반 방법을 사용하면 편집기가 유전체, 전사체 또는 후성유전체를 표적으로 하는지와 무관하게 폭넓은 유전체 편집 방식의 표적 외 편집 분석이 용이해질 것이다.

Current NGS technologies allow for the assessment of changes to genome/transcriptome/epigenome or quantification of mRNA abundance. Depending on the mechanism of action of the editor being used in a drug product, the sponsor may use an NGS-based method that enables evaluation of intended edits in the cells. For example, off-target editing risk of a drug product intended to methylate a cytosine base at a specific genomic site using an epigenome editor should be assessed with an NGS-based genome-wide DNA methylation analysis method. Using appropriate NGS-based method(s) would facilitate off-target editing analysis of a wide range of genome editing modalities, irrespective of whether an editor targets the genome, transcriptome, or epigenome.

이러한 방법을 적용할 때 사용한 실험 전략과 분석 변수의 적절성은 동료심사 문헌의 인용 또는 자체 수행한 분석으로 뒷받침되어야 한다. IV항의 NGS 사용에 관한 권고사항과 V항의 표적 편집 부위 평가에 관한 권고사항에 더하여, 표적 외 편집 부위 평가에 NGS를 적용할 때 FDA는 다음의 추가 권고사항을 제시한다.

The adequacy of the experimental strategy and analysis parameters used when implementing these methods should be supported with references to peer-reviewed publication(s) or any analyses performed in-house. In addition to the recommendations made on the use of NGS in section IV and on-target edit site assessment in section V, we have the following additional recommendations when implementing NGS for an off-target edit site assessment:

의뢰자는 지명된 표적 외 편집 부위를 검증하고 지명된 부위에서의 편집 빈도를 측정하기 위하여 적절한 세포 유형을 사용하여야 한다. 확인시험 방법에는 프로브 기반 서열 농축, 표적 서열 증폭 및/또는 그 밖의 동등한 방법이 포함될 수 있다. 지명된 모든 표적 외 편집 부위에 대하여 확인시험을 수행하는 것이 권장되나, 의뢰자는 지명된 표적 외 부위의 일부를 확인시험 대상으로 선정하고 그 전략을 뒷받침하는 과학적 타당성을 제출할 수 있다. 지명된 표적 외 편집 부위의 일부를 선정하는 근거에는 통계적 절단값 적용, 편집률 절단값, 여러 검체에서의 표적 외 부위 검출 또는 그 밖의 요인이 포함될 수 있다. 다만 지명된 표적 외 편집 부위에서의 편집률 평가가 가능하도록 엄격한 필터링 기준의 사용은 피하여야 한다.

The sponsor should use appropriate cell type(s) to verify the nominated off-target edit sites and to measure the editing frequency at the nominated sites. Confirmatory testing methods may include probe-based sequence enrichment, targeted sequence amplification, and/or other equivalent methods. While performing confirmatory testing at all the nominated off-target edit sites is recommended, the sponsor may select a subset of nominated off-target sites for confirmatory testing and provide scientific justification to support their strategy. The rationale for selecting a subset of nominated off-target edit sites may include applying statistical cut-offs, editing rate cut-off, detection of off-target sites in multiple samples, or other factors. However, use of stringent filtering criteria should be avoided to enable evaluation of editing rate at the nominated off-target edit sites.

확인시험 방법을 사용할 때 의뢰자는 편향을 최소화하는 염기서열 분석 전략을 선정하고, 저빈도 편집 사건의 평가가 가능한 미리 정한 염기서열 분석 깊이와 품질로 이를 적용하여야 한다(염기서열 분석 고려사항은 IV항 참조). 의뢰자는 자신의 시험 전략을 입증하는 근거로 확인시험 방법의 민감도와 그 밖의 정보를 보고할 수 있다. 확인시험은 적절한 세포 유형에서 수행하여야 한다(VI.A항 참조). 또한 표적 편집 부위와 모든 표적 외 편집 부위에서의 편집률을 결정하기 위하여 편집하지 않은 대조군과 편집한 검체의 쌍을 사용할 것이 권장된다. 이 시험에서 보고된 표적 편집 부위에서의 편집률은 의뢰자가 최종 의약품에서 제안한 의도된 표적 편집률과 비교 가능하여야 한다. 확인시험 결과의 보고에 관한 권고사항은 VI.F항을 참고한다.

When using a confirmatory testing method, the sponsor should select a sequencing strategy that minimizes bias and implement it at predetermined sequencing depth and quality that enables evaluation of low frequency editing events (see section IV for sequencing considerations). The sponsor may report the sensitivity of the confirmatory testing method and any other information as a rationale to justify their testing strategy. Confirmatory testing should be performed in appropriate cell type(s) (see section VI.A). Additionally, use of unedited control and edited sample pairs to determine edit rates at the on-target and all the off-target edit sites is recommended. The editing rates at the on-target edit site(s) reported from this study should be comparable to the intended on-target edit rates proposed by the sponsor in their final drug product. Please refer to section VI.F for recommendations on reporting the findings of the confirmatory testing study.

표적 외 편집 부위 지명 시험과 확인 시험에 사용하는 분석 변수는 실험 설계와 NGS 방법에 따라 달라진다. 편집을 위하여 서로 다른 형태의 PAM 서열을 인식하는 것으로 밝혀진 CRISPR-Cas 기반 편집기의 경우, 표적 외 편집 부위 확인 전략에는 서로 다른 형태의 PAM을 포함하여야 한다. 예를 들어 NGG는 spCas9의 전형적(canonical) PAM 서열이나, spCas9는 비전형적 PAM 서열도 인식하는 것으로 밝혀졌다. 의뢰자는 해당되는 경우 동료심사 문헌 또는 자체 생성 자료를 인용하여 자신의 PAM 선정 또는 제외 전략을 뒷받침하여야 한다.

Analysis parameters used for off-target edit site nomination and confirmation studies are specific to the experimental design and NGS method(s). For CRISPR-Cas-based editors that have been shown to recognize different versions of PAM sequence for editing, off-target edit site identification strategy should include different PAM versions. For example, NGG is a canonical PAM sequence for spCas9, but spCas9 has been shown to recognize non-canonical PAM sequences as well. The sponsor should reference peer-reviewed publication(s) or data generated in-house, as applicable, to support their PAM selection or exclusion strategy.

비편향 전장 유전체·엑솜·전사체·후성유전체 염기서열 분석 방법 또는 표적 염기서열 분석 방법으로 생성한 NGS 자료의 경우, 자료 분석에 사용한 필터링 변수의 세부사항을 보고하고 과학적 타당성과 함께 뒷받침하여야 한다. 염기서열 분석 방법에 특이적인 추가 분석 변수도 보고하고 타당성과 함께 뒷받침하여야 한다. 분석 단계와 변수를 기술할 때에는 IV항과 VI.C.2항의 권고사항을 참고한다.

For NGS data generated using either unbiased whole genome/exome/transcriptome/epigenome sequencing methods or targeted sequencing methods, details of the filtering parameters used for data analysis should be reported and supported with scientific justification. Any additional analysis parameters that are sequencing-method specific should also be reported and supported with justification. Please refer to our recommendations from section IV and section VI.C.2 when describing the analysis steps and parameters.

지명되고 확인된 표적 외 편집 부위를 보고할 때 의뢰자는 해당 표적 외 분석 시험에서 측정한 리드 수 및/또는 편집 빈도를 보고하여야 한다(해당되는 경우). 또한 FDA는 의뢰자가 표적 외 편집 부위의 유전체 좌표를 주석화하는 데 사용한 도구를 기술할 것을 권고한다. 지명 시험과 확인시험에서 보고된 모든 표적 외 편집 부위의 주석화된 목록에는 다음도 포함되어야 한다.

When reporting the nominated and confirmed off-target edit sites, the sponsor should report the read counts and/or editing frequencies measured from the respective off-target analysis study (as applicable). Additionally, we recommend that the sponsor describe the tool(s) that they used to annotate the genomic coordinates of off-target edit sites. An annotated list of all the off-target edit sites reported from nomination and confirmatory testing studies should also include the following:

확인된 모든 표적 외 편집 부위에 대하여, 의뢰자는 관련 유전체 위치에 관한 동료심사 문헌 정보, 유전자 발현 정보(해당되는 경우), 유전자-질병 연관성 연구(이용 가능한 경우) 및/또는 그 밖의 관련 정보와 같은 사전 지식을 사용하여 수행한 위해성 평가의 요약을 제출하여야 한다.

For all the confirmed off-target edit sites, the sponsor should submit a summary of the risk assessment performed using prior knowledge such as information from peer-reviewed publication(s) about the associated genomic location, gene expression information (if applicable), gene disease association studies (if available), and/or any other relevant information as applicable.

의약품의 표적 외 편집 활성은 편집기에 가한 아미노산 변형, 편집기의 전달 방식과 같은 추가 요인에 의해서도 영향을 받는다(표적 외 활성 평가 시험에서 전달 방법의 사용에 관한 권고사항은 VI.A.2항 참조). 편집 활성 및/또는 특이성을 변경하기 위하여 아미노산 잔기를 바꾸어 편집기를 변경한 경우에는 그러한 변형에 대한 상세한 설명을 제출하여야 한다. 의뢰자는 또한 편집기의 변경된 편집 활성 또는 특이성을 뒷받침하기 위하여 자체 생성한 추가 자료를 제출하거나 동료심사 문헌을 인용하여야 한다. 표적 외 편집 활성을 평가하는 시험은 최종 의약품에서 제안하는 유전체 편집기를 사용하여 수행하여야 한다. 편집기 발현의 지속성도 안전성 평가에 매우 중요하다.

Off-target editing activity of a drug product is further impacted by additional factors such as amino acid modification(s) made to the editor and the mode of delivery of the editor (see section VI.A.2 for recommendations on use of delivery methods for studies assessing off-target activity). If an editor is altered by changing amino acid residue(s) to modify editing activity and/or specificity, then a detailed description of such modification(s) should be provided. The sponsor should also provide additional data generated in-house or reference peer-reviewed publication(s) to support the modified editing activity or specificity of their editor. Studies assessing off-target editing activity should be performed using the genome editor proposed in the final drug product. The durability of editor expression is also crucial for safety assessment.

예를 들어 LNP를 사용하여 mRNA 분자로 전달되는 유전체 편집기의 활성은 같은 편집기를 AAV로 전달한 경우에 비하여 단기간일 가능성이 높으며, 이 정보는 안전성 평가의 일부로 보고하여야 한다. 편집 방식이 세포 내에서 장기간 지속적으로 발현될 가능성이 높은 경우(예: AAV로 전달되는 편집기, 생체내 전달되는 편집기)에는 추가적인 장기 표적 외 편집 위험 평가를 제출하여야 한다.

For example, the activity of a genome editor delivered as an mRNA molecule using a LNP will likely be short term compared to the same editor delivered using an AAV and this information should be reported as a part of the safety assessment. Additional long-term off-target editing risk assessments should be provided if the editing modality is likely to have sustained long-term expression in cells (e.g., AAV delivered editors, in vivo delivered editors).

개인의 사람 유전체에는 수백만 개의 뉴클레오타이드 변이가 존재한다. CRISPR-Cas 기반 편집기의 경우, 이러한 뉴클레오타이드 변이 중 일부는 유전체 부위와 gRNA 사이의 불일치를 줄이거나 PAM 서열을 만들어 편집이 일어날 수 있는 새로운 유전체 부위를 생성할 수 있다. 마찬가지로 그 밖의 편집 방식에서도 변이가 표적 서열과 유전체 상의 표적 외 편집 부위 사이의 불일치를 줄여 편집기의 서열 인식 도메인이 더 쉽게 인식할 수 있게 만들 수 있다. 어느 경우든 그 특정 변이를 가진 개인에게는 표적 외 편집 위험이 존재한다. 사람의 유전적 변이를 고려하는 적절한 인실리코 표적 외 분석 방법은 변이로 인하여 생기는 잠재적 표적 외 편집 부위를 보고할 수 있어야 한다. 이 분석에 관한 구체적인 권고사항과 추가 고려사항은 아래에 제시한다.

Individual human genomes harbor several million nucleotide variations. For CRISPR-Cas-based editors, some of these nucleotide variation(s) may either reduce mismatch(es) between a genomic site and a gRNA or may create a PAM sequence resulting in a new genomic site that is potentially amenable to editing. Similarly, for other editing modalities, a variant may reduce mismatch between the target sequence and a genomic off-target edit site making it potentially more amenable to recognition by sequence recognition domain of an editor. In either case, the off-target editing risk will be present in individuals harboring that specific variant. An adequate in silico off-target analysis method accounting for human genetic variation should enable reporting of potential off-target edit sites contributed by variant(s). Specific recommendations and additional considerations for this analysis are provided below.

의뢰자는 건강한 집단 및/또는 환자 집단의 변이 정보를 담고 있는 하나 이상의 사람 유전적 변이 데이터베이스를 선택하여야 한다. 변이 정보는 공개되어 이용 가능한 유전체 데이터베이스 또는 동등한 출처에서 얻은 것이어야 한다. 하나 이상의 데이터베이스를 사용하는 데 대한 적절한 과학적 타당성은 대상 집단에서의 질병 유병률, 흔한 뉴클레오타이드 변이에 관한 지식, 질병 유발 변이의 측면에서 제출하여야 한다.

Sponsors should choose one or more human genetic variation databases with variant information from healthy and/or patient populations. The variant information should be derived from published publicly available genomic databases or equivalent sources. Adequate scientific justification for using one or more databases should be provided in the context of disease prevalence in the intended population, knowledge of common nucleotide variations, and disease-causing variations.

GE 의약품이 유병률이 잘 특성분석된 질병의 치료에 사용되는 경우, 의뢰자는 특정 유전적 혈통에서의 질병 유병률에 기반하여 층화한 집단의 대립유전자 빈도에 따라 변이를 선정함으로써 유전적 변이성을 고려하는 인실리코 표적 외 편집 부위 지명 전략을 고려할 수 있다. 의뢰자는 분석에 집단 층화를 사용하는 전략을 뒷받침하는 과학적 타당성을 제출하여야 한다.

If the GE drug product is used to treat a disease with well-characterized prevalence, then sponsors may consider an in silico off-target edit site nomination strategy that accounts for genetic variability by selecting variants based on allele frequency in a population stratified based on disease prevalence in a specific genetic ancestry. The sponsor should provide scientific justification to support their strategy for using population stratification in their analysis.

인실리코 분석에는 유전체에 존재하는 흔한 변이와 드문 변이를 모두 포함할 것이 권장된다. 의뢰자는 데이터베이스에 보고된 모든 변이를 사용할 수도 있고, 이 분석을 위하여 일정 빈도 이상으로 존재하는 변이를 선정하는 데 대한 과학적 타당성을 제출할 수도 있다. 이 분석에는 유전자 내 변이와 유전자간 변이를 모두 포함할 것이 권장된다. 의뢰자는 분석에 변이 대립유전자 빈도 기준값을 사용하는 전략을 뒷받침하는 타당성을 제출하여야 한다.

Inclusion of both common and rare variants present in the genome for the in silico analysis is recommended. The sponsor may use all the variants reported in a database(s) or provide scientific justification for selecting variants that are present above a certain frequency for this analysis. Inclusion of all genic and intergenic variants in this analysis is recommended. The sponsor should provide justification to support their strategy for using variant allele frequency threshold in their analysis.

의뢰자는 변이가 불일치를 줄이거나 갭(gap)을 낮춤으로써 gRNA(또는 표적 서열)와 유전체 부위 사이의 상동성을 높인 부위를 확인할 수 있는 기준을 사용하여야 한다. CRISPR-Cas 기반 제품의 추가 기준에는 PAM 서열을 만들어 표적 외 편집 가능성을 높인 변이를 확인하는 것이 포함되어야 한다.

The sponsor should use criteria that enables identification of sites where the variant(s) increased homology between the gRNA (or target sequence) and the genomic site either by reducing mismatches and/or by lowering gaps. Additional criteria for CRISPR-Cas-based products should include identifying variants that increased off-target editing potential by creating a PAM sequence.

의뢰자는 변이에 의하여 생기는 표적 외 편집 부위에서의 편집 가능성을 평가하기 위하여 추가 분석을 수행할 수 있다. 이러한 분석에는 관심 변이를 가진 검체 또는 유전체 검체에서 편집률을 측정하는 실험적 방법이나, 편집 가능성의 지표로 점수·지표값을 산출하는 계산적 방법이 포함될 수 있다.

The sponsor may perform additional analyses to evaluate editing potential at variant contributed off-target edit sites. These analyses may include experimental methods to measure editing rates in samples or genomic samples harboring variant(s) of interest or computational methods that report scores/metrics as a readout for editing potential.

사람의 유전적 변이를 고려한 표적 외 편집 부위 분석에 대한 상세한 보고서에는 다음이 포함되어야 한다.

A detailed report of the off-target edit site analysis accounting for human genetic variation should include the following:

DNA 이중나선 절단 및/또는 중간 크기에서 큰 크기의 삽입 또는 결실(인델, indel)을 일으키는 것으로 알려진 유전체 편집 방식의 경우, 이중나선 절단 부위에서의 잘못된 DNA 수선 과정이 염색체 전위 사건을 일으켜 유전체 편집 후 세포의 유전체 완전성에 영향을 줄 수 있다. 이러한 경우 편집된 세포의 유전체 완전성에 대하여 민감하고 정량적인 NGS 기반 평가를 수행할 것이 권장된다. 의뢰자는 저빈도 전위 사건을 검출하고 GE 중 이중나선 절단 사건이 일어난 표적 유전체 부위 사이의 염색체 전위율을 보고하기 위하여 표적 염기서열 분석 및/또는 프라이머 기반 염기서열 분석이나 그 밖의 유전체 전역 NGS 기반 방법의 선택을 고려할 수 있다.

For genome editing modalities known to create DNA double-strand breaks and/or medium to large insertions or deletions (or indels), erroneous DNA repair processes at double strand break sites may result in chromosomal translocation event(s) that can impact genomic integrity of cells post-genome editing. In these instances, sensitive and quantitative NGS-based assessment of genomic integrity in edited cells is recommended. The sponsor may consider choosing targeted sequencing and/or primer-based sequencing or other genome-wide NGS-based methods to detect low frequency translocation events and report chromosomal translocation rate(s) between on-target genomic site(s) where double strand break events occurred during GE.

FDA는 이러한 유형의 분석을 수행할 때 의뢰자가 민감하고 편향을 최소화하는 염기서열 분석 전략을 사용할 것을 권고한다(NGS 고려사항은 IV항 참조). 의약품의 안전성 분석에서 확인된 표적 외 편집 부위가 보고된 경우, 표적 편집 부위와 표적 외 편집 부위 사이의 잠재적 전위 사건을 평가하는 추가 평가를 수행하여야 한다. 검체 선정은 VI.A항, 염기서열 분석 고려사항은 IV항, 이 분석에서 확인된 부위의 주석화된 목록 보고는 VI.F항을 참고한다.

We recommend that the sponsor use a sequencing strategy that is sensitive and that minimizes bias when performing this type of analysis (see section IV for NGS considerations). If confirmed off-target edit site(s) were reported from safety analyses of the drug product, then an additional assessment to evaluate potential translocation events between on-target and off-target edit sites should be performed. Please refer to section VI.A for sample selection, IV for sequencing considerations, and VI.F for reporting an annotated list of sites identified from this analysis.

권고된 모든 비임상 표적 외 편집 시험과 염색체 전위 시험은 이 가이던스의 권고사항에 따라 수행하여야 하며, 최초 임상시험계획(IND) 신청 제출 전에 완료하여야 한다. 상세한 시험 보고서에는 이 가이던스에서 권고한 모든 정보를 포함하여야 하며, 최초 IND 신청과 함께 제출하여야 한다. 표적 외 편집 시험과 염색체 전위 시험의 결과도 권고된 형식으로 최초 IND 신청과 함께 제출하여야 한다. 제안된 적응증이 초희귀질환인 경우나 단일 환자의 치료를 목적으로 하는 경우와 같이 일부 경우에는 사람의 유전적 변이를 고려하여 표적 외 편집 활성을 평가하는 시험이 최초 IND 제출 시에 필요하지 않을 수 있다. 의뢰자는 IND 신청 제출 전에 자신의 시험 계획을 FDA와 논의할 것을 권장한다.

All the recommended nonclinical off-target editing and chromosomal translocation studies should be performed based on the recommendations made in this guidance and completed prior to the submission of an original IND application. A detailed study report should include all the information recommended in this guidance and should be submitted with the original IND application. The results of the off-target editing and chromosomal translocation studies should also be submitted in recommended format(s) with the original IND application. Studies assessing off-target editing activity by accounting for human genetics variations may not be necessary with an original IND submission in some cases such as when the proposed indication is an ultra-rare disease or when it is intended for the treatment of a single patient. Sponsors are encouraged to discuss their study plan with the FDA prior to the submission of their IND application.

구체적으로 의뢰자는 표적 외 편집 활성 평가 전략을 논의하기 위하여 INTERACT 또는 pre-IND 방식의 회의 선택지를 모색할 것을 권장한다(Refs. 2, 3). 의뢰자는 이러한 제출자료에 자신의 표적 외 분석 계획에 대한 간략한 설명을 제출할 수 있다. 사전 제출 자료에 포함될 수 있는 정보의 유형은 아래 표에 요약하였다.

Specifically, sponsors are encouraged to explore meeting options to discuss their strategies assessing off-target editing activity in an INTERACT or pre-IND setting (Refs. 2, 3). The sponsor may provide a brief description of their off-target analysis plan in these submissions. The type of information that may be included in the pre-submission files is summarized in the table below.

제조공정의 중대한 변경이 편집기 활성 및/또는 표적 부위에서의 편집률에 영향을 주어 의약품의 표적 외 편집 부위 양상에 영향을 미칠 가능성이 있는 경우, 제품 개발 중 추가적인 표적 외 편집 분석이 필요할 수 있다. 또한 안전성 문제가 확인된 경우에도 추가적인 표적 외 편집 분석이 필요할 수 있다. 의뢰자는 제조공정 변경이 의약품의 표적 외 편집 위험에 미치는 영향을 평가하는 전략을 FDA와 논의하기 위하여 공식 회의 선택지를 모색할 것을 권장한다(Ref. 3).

Additional off-target editing analysis may be needed during product development if major changes to the manufacturing process(es) impacts either the editor activity and/or editing rate(s) at on-target site(s) that may potentially impact the off-target edit site profile of the drug product. Furthermore, additional off-target editing analysis may be needed if safety issues are identified. Sponsors are encouraged to explore formal meeting options to discuss strategies to assess the impact of changes in manufacturing process(es) on off-target editing risk of their drug product with the FDA (Ref. 3).

IND 하에서 수행하는 임상시험 중 또는 BLA 제출 시에 의뢰자는 원시 염기서열 자료와 그 염기서열 자료를 분석하는 데 사용한 소프트웨어 스크립트를 제출해야 할 수 있다. 의뢰자는 제품 개발 중 및/또는 BLA 제출 전에 이를 FDA와 논의하여야 한다.

During the clinical studies conducted under an IND or in the BLA submission, the sponsor may need to submit the raw sequencing data and the associated software script(s) used to analyze the sequencing data. The sponsor should discuss this with the FDA during product development and/or prior to the submission of their BLA.