이 가이던스는 이 주제에 관한 FDA의 현재 견해를 나타낸다. 이 가이던스는 누구에게도 어떠한 권리를 만들지 않으며, FDA나 일반 대중을 구속하지 않는다. 적용 법률과 규정의 요건을 충족한다면 다른 접근 방법을 사용할 수 있다. 다른 접근 방법을 논의하려면 표지에 적힌, 이 가이던스를 담당하는 FDA 부서에 연락한다.

This guidance represents the current thinking of the Food and Drug Administration (FDA or Agency) on this topic. It does not establish any rights for any person and is not binding on FDA or the public. You can use an alternative approach if it satisfies the requirements of the applicable statutes and regulations. To discuss an alternative approach, contact the FDA office responsible for this guidance as listed on the title page.

이 가이던스는 임상시험 중 치료용 단백질 제품의 면역원성을 평가하는 시험법을 업계가 개발하고 밸리데이션하는 데 도움이 되도록 권고사항을 제시한다. 구체적으로, 이 문서는 선별시험(screening assay), 확인시험(confirmatory assay), 역가시험(titration assay), 중화시험(neutralization assay)의 개발과 밸리데이션에 관한 지침을 담고 있다.^2,3 이 가이던스에서 면역원성은 치료용 단백질 제품이 그 자신과 관련 단백질에 대한 면역반응을 일으키거나 면역학적으로 관련된 임상 이상사례를 유발하는 경향으로 정의한다. 이 문서에 제시된 시험법 개발 및 밸리데이션 권고사항은 하나 이상의 항약물항체(ADA)를 검출하는 시험법에 적용된다.⁴

This guidance provides recommendations to facilitate industry’s development and validation of assays for assessment of the immunogenicity of therapeutic protein products during clinical trials. Specifically, this document includes guidance regarding the development and validation of screening assays, confirmatory assays, titration assays, and neutralization assays.^2,3 For the purposes of this guidance, immunogenicity is defined as the propensity of a therapeutic protein product to generate immune responses to itself and to related proteins or to induce immunologically related adverse clinical events. The recommendations for assay development and validation provided in this document apply to assays for the detection of one or more anti-drug antibodies (ADAs).⁴

이 가이던스는 일부 펩타이드, 올리고뉴클레오타이드, 복합제품(combination product)에도 사안별로 적용될 수 있다.⁵

This guidance may also apply to some peptides, oligonucleotides, and combination products on a case-by-case basis.⁵

일반적으로 이 문서는 ADA 시험의 근거나 면역원성에 기여할 수 있는 대상자 및 제품 특이적 위험 요인은 다루지 않는다.⁶ 또한 이 가이던스는, 여기서 쓰인 용어에 관한 설명을 포함하여, 체외진단용 제품에는 적용되지 않는다.⁷

In general, this document does not discuss the rationale for ADA testing or the subject- and product-specific risk factors that may contribute to immunogenicity.⁶ Also, this guidance, including any discussions of terminology used in this guidance, does not apply to in vitro diagnostic products.⁷

일반적으로 FDA의 가이던스 문서는 법적 구속력이 있는 책임을 규정하지 않는다. 가이던스는 어떤 주제에 관한 FDA의 현재 견해를 설명하는 것이며, 특정 규제 또는 법령 요건이 인용된 경우가 아니면 권고사항으로만 보아야 한다. FDA 가이던스에서 should(~하여야 한다)라는 단어는 어떤 것을 제안하거나 권고한다는 뜻이며, 요구한다는 뜻은 아니다.

In general, FDA’s guidance documents do not establish legally enforceable responsibilities. Instead, guidances describe the Agency’s current thinking on a topic and should be viewed only as recommendations, unless specific regulatory or statutory requirements are cited. The use of the word should in Agency guidances means that something is suggested or recommended, but not required.

치료용 단백질 제품에 대한 면역반응은 제품의 약동학, 약력학, 안전성 및 유효성에 영향을 줄 수 있다.⁸ 대상자에서 나타나는 면역반응의 임상적 영향은 측정 가능한 영향이 전혀 없는 경우부터 극도로 해로운 경우까지 매우 다양하다. ADA 생성의 검출과 분석은 잠재적 면역반응을 이해하는 데 유용한 도구이다. 임상시험 중 관찰된 면역반응에 관한 정보, 특히 ADA 유도 발생률이나 ADA 반응이 약동학, 약력학, 안전성 또는 유효성에 미치는 영향은 모든 치료용 단백질 제품 개발 프로그램에서 매우 중요하다. 따라서 이러한 정보는 해당하는 경우 처방정보의 이상반응(ADVERSE REACTIONS) 항 아래 면역원성(Immunogenicity)이라는 하위 항에 포함하여야 한다.⁹

Immune responses to therapeutic protein products have the potential to affect product pharmacokinetics, pharmacodynamics, safety, and efficacy.⁸ The clinical effects of immune responses in subjects are highly variable, ranging from no measurable effect to extremely harmful. Detection and analysis of ADA formation is a helpful tool in understanding potential immune responses. Information on immune responses observed during clinical trials, particularly the incidence of ADA induction or any implications of ADA responses affecting pharmacokinetics, pharmacodynamics, safety, or efficacy, is crucial for any therapeutic protein product development program. Accordingly, such information, if applicable, should be included in the prescribing information as a subsection of the ADVERSE REACTIONS section entitled Immunogenicity.⁹

그러므로 ADA 반응을 측정하는 타당하고 감도·특이성·선택성이 있는 시험법을 개발하는 것은 치료용 단백질 제품 개발의 핵심 요소이다.

Therefore, the development of valid, sensitive, specific, and selective assays to measure ADA responses is a key aspect of therapeutic protein product development.

치료용 단백질 제품에 대해 ADA를 생성하는 면역반응이 일어날 때 대상자에게 미치는 위험은 제품에 따라 다르다. FDA는 치료용 단백질 제품의 약동학, 약력학, 안전성 및 유효성에 영향을 주는 면역반응, 또는 그 제품과 관련된 면역학적 임상 이상사례를 평가하고 관리할 때 위험 기반 접근 방법을 채택할 것을 권고한다.¹⁰ 면역원성 시험은 중화 활성이나 과민반응처럼 원하지 않는 생물학적 또는 생리학적 결과를 매개할 수 있는 ADA를 검출하도록 설계하여야 한다.

The risk to subjects from mounting an ADA-generating immune response to a therapeutic protein product will vary with the product. FDA recommends adopting a risk-based approach to evaluating and managing immune responses to — or immunologically related adverse clinical events associated with — therapeutic protein products that affect their pharmacokinetics, pharmacodynamics, safety, and efficacy.¹⁰ Immunogenicity tests should be designed to detect ADA that could mediate unwanted biological or physiological consequences such as neutralizing activity or hypersensitivity responses.

결합항체 시험이라고도 하는 선별시험은 치료용 단백질 제품에 결합하는 항체를 검출하는 데 사용한다. 치료용 단백질 제품에 대한 ADA의 특이성은 보통 확인시험에서 치료용 단백질과의 경쟁으로 확립한다. ADA는 역가시험과 중화시험으로 추가로 특성분석한다. 역가시험은 ADA 반응의 크기를 특성분석한다. ADA가 약동학, 약력학, 안전성 및 유효성에 미치는 영향은 발생률보다 ADA 역가 및 지속성과 상관관계가 있을 수 있으므로, 역가시험으로 이 크기를 특성분석하는 것이 중요하다(Cohen and Rivera 2010). 중화항체(NAb)는 치료용 단백질 제품과 그 표적 사이의 상호작용을 방해할 수 있는 ADA를 말한다. 중화시험은 ADA의 중화 활성을 평가한다.

Screening assays, also known as binding antibody assays, are used to detect antibodies that bind to the therapeutic protein product. The specificity of ADA for the therapeutic protein product is usually established by competition with a therapeutic protein in a confirmatory assay. ADAs are characterized further using titration and neutralization assays. Titration assays characterize the magnitude of the ADA response. It is important to characterize this magnitude with titration assays because the impact of ADA on pharmacokinetics, pharmacodynamics, safety, and efficacy may correlate with ADA titer and persistence rather than incidence (Cohen and Rivera 2010). Neutralizing antibodies (NAbs) refer to those ADA with the ability to interfere with interactions between the therapeutic protein product and its target. Neutralization assays assess ADA for neutralizing activity.

ADA가 약동학, 약력학, 안전성 및 유효성에 미치는 영향은 ADA 발생률보다 NAb 활성과 상관관계가 있을 수 있으므로, ADA의 중화 활성을 특성분석하는 것이 중요하다(Calabresi et al. 2007; Goodin et al. 2007; Cohen and Rivera 2010; Wang et al. 2016; Wu et al. 2016). 마찬가지로, 면역원성 위험성 평가에 따라 일부 경우에는 NAb 정성 결과(예: 양성 또는 음성)에 더해 NAb 역가를 확립하는 것이 유용할 수 있다. 아이소타입 분석, 에피토프 매핑, 교차반응성 평가(예: 내재성 대응 단백질이나 다른 제품에 대한) 등 추가 특성분석 시험이 유용할 수 있다.

It is important to characterize neutralizing activity of ADA because the impact of ADA on pharmacokinetics, pharmacodynamics, safety, and efficacy may correlate with NAb activity rather than ADA incidence (Calabresi et al. 2007; Goodin et al. 2007; Cohen and Rivera 2010; Wang et al. 2016; Wu et al. 2016). Similarly, in some cases it may be useful to establish NAb titers in addition to NAb qualitative results (for example, positive or negative), depending on immunogenicity risk assessment. Additional characterization assays, including isotyping, epitope mapping, and assessing cross-reactivity (for example, to endogenous counterparts or to other products), may be useful.

치료용 단백질 제품 개발 중 ADA 시험법을 설계, 개발 및 밸리데이션하기에 가장 적절한 시점은 그 제품의 위험성 평가에 따라 달라진다(Mire-Sluis et al. 2004; Gupta et al. 2007; Shankar et al. 2008; Gupta et al. 2011). 의뢰자는 최초 임상시험계획(IND) 신청 시 면역원성 위험성 평가와 함께 면역원성 시험 체계의 근거를 제출하여야 한다. FDA는 의뢰자가 1상 및 2상 시험 동안 적합한 선별시험, 확인시험 및 경우에 따라 중화시험을 사용하여 시료를 시험할 것을 권장한다. 핵심 임상시험에서 얻은 시료는 완전히 밸리데이션된 시험법으로 시험하여야 한다.¹¹

The optimal time to design, develop, and validate ADA assays during therapeutic protein product development depends on the risk assessment of the product (Mire-Sluis et al. 2004; Gupta et al. 2007; Shankar et al. 2008; Gupta et al. 2011). The sponsor should provide an immunogenicity risk assessment as well as a rationale for the immunogenicity testing paradigm in the original investigational new drug application (IND). FDA encourages sponsors to test samples during phase 1 and phase 2 studies using suitable screening, confirmatory, and in some instances neutralization assays. Samples derived from pivotal clinical studies should be tested with fully validated assays.¹¹

면역원성의 임상적 위험이 높고 대상자 반응에 관한 실시간 데이터가 필요한 경우(예: 기능이 중복되지 않는 내재성 대응 단백질이 있는 경우), FDA는 임상시험 개시 전에 사용 목적에 적합한 시험법을 개발하고 시험을 실시간으로 수행하도록 요청할 수 있다. 이러한 경우 ADA 평가의 시기와 보고는 FDA와 협의하여야 한다. 그 밖의 상황에서는 의뢰자가 적합한 시험법이 마련되었을 때 시험할 수 있도록 대상자 시료를 보관할 수 있다. 허가신청 시점에 의뢰자는 시험법의 완전한 밸리데이션을 뒷받침하는 데이터를 제출하여야 한다(VIII항 참조). ADA 시료 채취 시기에 관한 권고사항은 VII.A항에 제시되어 있다.¹²

When immunogenicity poses a high clinical risk and real-time data concerning subject responses are needed (for example, when there is an endogenous counterpart with non-redundant function), FDA may request that assays suitable for their intended purpose be developed before initiating clinical studies and that testing be performed in real time. In such instances, timing and reporting of ADA assessment should be discussed with the Agency. In other situations, the sponsor may store subject samples so they can be tested when suitable assays are available. At the time of license application, the sponsor should provide data supporting full validation of the assays (see section VIII). Recommendations regarding the timing of ADA sample collection are provided in section VII.A.¹²

ADA 검출 시험 결과는 치료용 단백질 제품의 면역원성, 약동학, 약력학, 안전성 및 유효성을 이해하는 데 도움이 된다. 그러나 ADA 검출은 시험법의 주요 운영 변수, 예를 들어 감도와 특이성에 좌우된다.¹³ ADA 발생률 정보는 보통 처방정보의 이상반응(ADVERSE REACTIONS) 항 중 면역원성 하위 항에 포함되지만, ADA 생성의 검출은 시험법의 감도, 특이성 및 약물 내성(drug tolerance) 수준에 크게 좌우되므로, 서열이나 구조의 상동성을 공유하는 제품이라 하더라도 제품 간 ADA 발생률을 비교하면 오해를 불러올 수 있음을 FDA는 경고한다. 또한 관찰된 ADA 발생률은 시험방법, 시료 취급, 시료 채취 시기, 병용약물, 질병 상태 등 여러 요인의 영향을 받는다.

Results from assays for detection of ADA facilitate understanding of the immunogenicity, pharmacokinetics, pharmacodynamics, safety, and efficacy of therapeutic protein products. However, detection of ADA is dependent on key operating parameters of the assays; for example, sensitivity, specificity.¹³ Although information on ADA incidence is typically included in the prescribing information under an Immunogenicity subsection of the ADVERSE REACTIONS section, FDA cautions that comparison of ADA incidence across products, even for products that share sequence or structural homology, can be misleading because detection of ADA formation is highly dependent on the sensitivity, specificity, and drug tolerance level of the assay. Additionally, the observed incidence of ADA is influenced by multiple factors including method, sample handling, timing of sample collection, concomitant medications, and disease condition.

따라서 완전히 밸리데이션된 시험법을 사용하더라도, 같은 적응증에서 구조적 상동성이 있는 치료용 단백질 제품 간에 면역원성 비율을 비교하는 것은 타당하지 않다. 상동성이 있는 서로 다른 치료용 단백질 제품 간, 또는 출처가 다른 유사 치료용 단백질 간에 면역원성을 직접 비교할 필요가 있는 경우, 비교 데이터는 직접 비교(head-to-head) 임상시험을 실시하여 얻어야 하며, 이때 얻은 시료는 두 치료용 단백질 제품에 대한 항체에 대해 동등한 감도와 특이성을 가진다고 입증된 시험법으로 시험하여야 한다.

Therefore, comparing immunogenicity rates across therapeutic protein products with structural homology for the same indication is unsound, even though fully validated assays are employed. When a direct comparison of immunogenicity across different therapeutic protein products that have homology — or across similar therapeutic proteins from different sources — is needed, the comparison data should be obtained by conducting a head-to-head clinical study from which samples obtained are tested using an assay demonstrated to have equivalent sensitivity and specificity for antibodies against both therapeutic protein products.

이 가이던스에 제시된 시험법 개발 및 밸리데이션 권고사항은 FDA가 면역원성 제출자료를 검토하면서 흔히 마주친 문제에 근거한다. 의뢰자는 제품별 조언이 필요하면 FDA에 문의하여야 하며, 특히 고위험 제품, 예를 들어 기능이 중복되지 않는 내재성 대응 단백질이 있는 제품의 경우 그러하다.¹⁴ 아이소타입 분석, 에피토프 매핑, 내재성 대응 단백질과의 교차반응성을 위한 시험법 설계는 FDA와 협의하여야 한다. 추가적인 이해를 위해 다른 문헌을 참고할 수도 있다(Mire-Sluis et al. 2004; Gupta et al. 2007; Shankar et al. 2008; Gupta et al. 2011).¹⁵

The recommendations on assay development and validation provided in this guidance are based on common issues encountered by the Agency upon review of immunogenicity submissions. Sponsors should contact FDA for any product-specific advice, particularly for high-risk products; for example, products with endogenous counterparts that have non-redundant function.¹⁴ Assay designs for isotyping, epitope mapping, and cross-reactivity with endogenous counterparts should be discussed with FDA. Other publications may also be consulted for additional insight (Mire-Sluis et al. 2004; Gupta et al. 2007; Shankar et al. 2008; Gupta et al. 2011).¹⁵

일반적으로 FDA는 의뢰자가 감도, 특이성, 선택성, 약물 내성, 정밀성, 재현성 및 완건성이 최적화된 시험법을 개발할 것을 권고한다(IV.C항부터 IV.H항까지 참조).

In general, FDA recommends that sponsors develop assays that are optimized for sensitivity, specificity, selectivity, drug tolerance, precision, reproducibility, and robustness (see sections IV.C through H).

이 항은 따로 명시하지 않는 한 모든 유형의 ADA 검출 시험법에 적용된다. 생체시료분석 과학자는 새로 등장하는 과학에 근거하여 이러한 요인과 그 밖의 요인의 적용 가능성을 평가하여야 한다. 이 문제에 관한 FDA의 견해는 과학이 발전함에 따라 바뀔 수 있다.

This section applies to all types of assays for detection of ADA, unless specified otherwise. The bioanalytical scientist should evaluate the applicability of these factors and others based on emerging science. FDA’s thinking on this matter may change as the science evolves.

FDA는 다단계(multi-tiered) ADA 시험 접근 방법을 권고한다(부록 참조). 이 체계에서는 먼저 감도가 높은 선별시험으로 임상 시료를 평가한다. ADA 반응의 자연 경과를 더 정확히 이해하려면, 선별시험은 감도가 높아야 하고, 예를 들어 세척 단계를 최소화하는 방식으로 저친화성 및 고친화성 ADA를 낮은 수준에서도 검출하도록 설계하여야 한다. 그러나 대부분의 경우 최초 선별시험에서 검출된 항체의 친화성을 실험적으로 측정할 필요는 없다. 선별시험에서 양성으로 나온 시료는 이어서 확인시험을 거쳐 ADA가 치료용 단백질 제품에 특이적임을 입증한다.

FDA recommends a multi-tiered ADA testing approach (see Appendix). In this paradigm, a sensitive screening assay is initially used to assess clinical samples. To gain a more accurate understanding of the natural history of the ADA response, the screening assay should be sensitive and designed to detect low levels of low- and high-affinity ADA; for example, by minimizing wash steps. However, in most cases it is not necessary to empirically determine the affinity of antibodies that are detected by the initial screening assay. Samples testing positive in the screening assay are then subjected to a confirmatory assay to demonstrate that ADAs are specific for the therapeutic protein product.

예를 들어, 경쟁시험을 통해 항체가 치료용 단백질 제품에 특이적으로 결합하고 있으며, 선별시험의 양성 결과가 시험 혈청이나 검출 시약이 플라스틱이나 다른 단백질 같은 시험 환경 내 다른 물질과 비특이적으로 상호작용한 결과가 아님을 확인할 수 있다.

For example, a competition assay could confirm that an antibody is specifically binding to the therapeutic protein product and that the positive finding in the screening assay is not a result of non-specific interactions of the test serum or detection reagent with other materials in the assay milieu such as plastic or other proteins.

확인시험에서 양성으로 판정된 시료는 역가시험과 중화시험 같은 다른 시험으로 추가 특성분석하여야 한다. 일부 경우에는 해당 내재성 단백질 같은 다른 단백질에 대한 교차반응성을 검출하는 시험이 필요할 수 있다. 예를 들어, 치료용 단백질 제품이 상동성이 높은 단백질군에 속하고 그 군의 다른 구성원이 ADA의 영향을 받는지 아는 것이 중요할 때 교차반응성 평가가 필요할 수 있다. 또한 일부 경우에는 항체를 함유한 시료가 양성으로 확인되면 항체의 아이소타입이나 에피토프 특이성을 평가하는 시험도 권고될 수 있다. ADA 반응의 에피토프 특이성 측정은 자주 수행되지 않지만, 페길화 단백질, 항체-약물 접합체, 이중특이성 항체 같은 다중 도메인 제품에 대해서는 보다 일반적인 도메인 특이성 평가를 수행하는 것이 흔하다(IV.A.3항 참조).

Samples identified as positive in the confirmatory assay should be further characterized in other assays, such as titration and neutralization assays. In some cases, assays to detect cross-reactivity to other proteins, such as the corresponding endogenous protein, may be needed. For example, assessment of cross-reactivity may be needed when the therapeutic protein product belongs to a family of proteins with high homology and it is important to know whether other family members are affected by ADA. Further, in some cases tests to assess the isotype of the antibodies or their epitope specificity may also be recommended once samples containing antibodies are confirmed as positive. Epitope specificity determination of the ADA response is not frequently performed, although it is common to perform a more general assessment of domain specificity for multi-domain products such as pegylated proteins, antibody-drug conjugates, and bispecific antibodies (see section IV.A.3).

최초 선별시험은 관련된 모든 면역글로불린(Ig) 아이소타입을 검출할 수 있어야 한다. 점막 외 투여 경로이고 아나필락시스 위험이 없는 경우, 관련 ADA 아이소타입은 IgM과 IgG이다. 점막 투여 경로의 경우 IgA 아이소타입 ADA도 관련이 있다.¹⁶ FDA는 선별시험에서 관련된 모든 아이소타입이 검출될 것을 기대하지만, 선별시험이 어떤 아이소타입을 검출하고 있는지까지 규명할 필요는 없다. 예를 들어, 브리지 시험(bridging assay) 형식은 이론적으로 대부분의 아이소타입 항체를 검출할 수 있지만 어떤 아이소타입이 검출되고 있는지에 관한 정보는 제공하지 않는다.¹⁷

The initial screening assay should be able to detect all relevant immunoglobulin (Ig) isotypes. For non-mucosal routes of administration and in the absence of a risk of anaphylaxis, the relevant ADA isotypes are IgM and IgG. For mucosal routes of administration, IgA isotype ADAs are also relevant.¹⁶ Although FDA expects that all relevant isotypes be detected in screening assays, it is not necessary that the screening assay establishes which isotypes are being detected. For example, the bridging assay format can theoretically detect antibodies of most isotypes but does not provide information on which isotypes are being detected.¹⁷

어떤 상황에서는 의뢰자가 항체 아이소타입을 구별하는 시험법을 개발하여야 한다. 예를 들어, 아나필락시스 위험이 높거나 아나필락시스가 관찰된 치료용 단백질 제품의 경우 항원 특이적 IgE 시험 결과가 유익할 수 있다.

In some circumstances the sponsor should develop assays that discriminate between antibody isotypes. For example, for therapeutic protein products where there is a high risk for anaphylaxis or where anaphylaxis has been observed, results from antigen-specific IgE assays may be informative.

일부 상황에서는 ADA 아형 평가가 유익할 수 있다. 예를 들어, IgG4 항체의 생성은 제VIII인자 치료처럼 만성적인 항원 노출 조건에서 생기는 면역반응, 그리고 에리스로포이에틴 투여 대상자의 순수 적혈구 무형성증과 연관되어 왔다(Matsumoto et al. 2001; Aalberse and Schuurman 2002). 따라서 임상적 우려에 따라 특정 아이소타입이나 아형에 대한 평가가 필요할 수 있다.

Assessment of ADA subtype may be informative in some situations. For example, the generation of IgG4 antibodies has been associated with immune responses generated under conditions of chronic antigen exposure, such as factor VIII treatment, and in erythropoietin-treated subjects with pure red cell aplasia (Matsumoto et al. 2001; Aalberse and Schuurman 2002). Consequently, depending on the clinical concern, assessing for specific isotypes or subtypes may be needed.

일부 단백질은 서로 다른 방식으로 기능하여 임상적 유효성을 매개하는 여러 도메인을 가진다. 한 도메인에 대한 면역반응은 다른 기능은 그대로 둔 채 특정 기능만 억제할 수 있다. FDA는 의뢰자가 최초 선별시험과 확인시험을 치료용 단백질 제품 전체를 대상으로 수행할 것을 권고한다. 다중 도메인 치료용 단백질 제품의 경우, 의뢰자는 ADA가 단백질의 임상적으로 관련된 특정 도메인에 결합하는지 조사하여야 할 수 있다. 예를 들어, 페길화 같은 변형이 있는 치료용 단백질 제품에서 ADA가 대상자에게 미치는 위험을 적절히 이해하려면, 의뢰자는 단백질 성분뿐 아니라 치료용 단백질 제품의 변형 부위에 대한 ADA의 특이성도 측정하는 시험법을 개발하여야 한다(Gorovits et al. 2014).

Some proteins possess multiple domains that function in different ways to mediate clinical efficacy. An immune response to one domain may inhibit a specific function while leaving others intact. FDA recommends that sponsors direct initial screening and confirmatory tests against the whole therapeutic protein product. For multi-domain therapeutic protein products, the sponsor may need to investigate whether the ADA binds to specific clinically relevant domains in the protein. For example, to adequately understand the risk of ADA to subjects for therapeutic protein products with modifications such as pegylation, sponsors should develop assays to determine the specificity of ADA for the protein component as well as the modification to the therapeutic protein product (Gorovits et al. 2014).

도메인 특이성은 일반적으로 전체 분자를 사용하여 양성으로 확인된 ADA 시료에서 평가한다. 이중특이성 항체처럼 여러 기능 도메인을 가진 치료용 단백질 제품에 대한 면역반응을 조사하려면, 분자의 서로 다른 도메인에 대한 면역반응을 측정하는 여러 시험법을 개발하여야 할 수 있다(IV.L.4항 참조).

The domain specificity is generally assessed in ADA samples confirmed positive using the whole molecule. Examination of immune responses to therapeutic protein products with multiple functional domains such as bispecific antibodies may require development of multiple assays to measure immune responses to different domains of the molecules (see section IV.L.4).

시험법의 컷포인트(cut-point)는 시료 반응을 양성 또는 음성으로 판정하는 시험 반응 수준이다. 시험법 유형별 컷포인트 설정에 관한 구체적인 정보는 V항과 VI항에 제시되어 있다. 적절한 컷포인트를 설정하는 것은 위음성 결과의 위험을 최소화하는 데 매우 중요하다.

The cut-point of the assay is the level of response of the assay that defines the sample response as positive or negative. Information specific to establishing the cut-point for the respective assay types is provided in sections V and VI. Establishing the appropriate cut-point is critical to minimizing the risk of false-negative results.

시험법의 컷포인트는 간섭을 일으키는 수많은 제품 또는 매트릭스 성분의 영향을 받을 수 있다.¹⁸ 이러한 성분은 시험법 개발 초기에 컷포인트를 정할 때 고려하여야 하며, IV.K항에서 자세히 다룬다. 서로 다른 표적 집단과 질병 상태에서 얻은 시료에는 시험의 바탕 신호를 변동시킬 수 있는 성분이 있을 수 있으므로, 구별되는 집단마다 서로 다른 컷포인트가 필요할 수 있다.

The cut-point of the assay can be influenced by a myriad of interfering product or matrix components.¹⁸ These components should be considered early on in assay development when defining the cut-point and are discussed in detail in section IV.K. Because samples from different target populations and disease states may have components that can cause the background signal from the assay to vary, different cut-points may be needed for discrete populations.

가능하면 컷포인트는 투약 경험이 없는(treatment-naïve) 대상자의 시료를 사용하여 통계적으로 정하여야 한다.¹⁹ 이 시료로 반복 시험을 수행하면 시험법의 변동성을 추정할 수 있다. 컷포인트를 정하는 데 사용하는 통계적 접근 방법에는 분석에서 통계적 이상값을 제거하는 것, 기존 항체(pre-existing antibody)를 반영하는 방법을 사용하는 것 등 여러 과정이 포함될 수 있다. 시험법 개발 중에는 적은 수의 시료로 컷포인트를 추정할 수 있다.

Where feasible, the cut-point should be statistically determined using samples from treatment-naïve subjects.¹⁹ By performing replicate assay runs with these samples, the variability of the assay can be estimated. The statistical approach employed to determine the cut-point may entail various processes, such as removing statistical outliers from analyses, and using an approach to account for pre-existing antibodies. During assay development, a small number of samples may be used to estimate the cut-point.

의뢰자는 컷포인트를 설정할 때 통계적으로 판정된 이상값과 진양성 시료의 영향을 고려하여야 한다. 의뢰자는 데이터 포인트를 제거한 경우 그 타당성과 함께 이상값으로 판정하는 데 사용한 방법을 제시하여야 한다. 이상값 제외에 관한 우려가 있으면 의뢰자는 FDA와 협의하여야 한다.

The sponsor should consider the impact of statistically determined outlier values and true-positive samples when establishing the cut-point. The sponsor should provide justification for the removal of any data points, along with the respective method used to determine their status as outliers. Sponsors should consult with FDA if there is a concern regarding the exclusion of outliers.

외견상 양성인 값과 시료는 대상자 시료에 기존 항체나 그 밖의 혈청 인자가 있어서 나타날 수 있다(Ross et al. 1990; Turano et al. 1992; Coutinho et al. 1995; Caruso and Turano 1997; van der Meide and Schellekens 1997; Boes 2000). 다양한 내재성 단백질에 대한 기존 항체는 건강한 사람에게도 있지만, 일부 질병 상태에서는 훨씬 높을 수 있다. 의뢰자는 기존 항체가 있는 시료를 (예: 약물과의 경쟁을 통해) 식별하여 컷포인트 분석에서 제외하여야 한다.

Apparent positive values and samples may derive from the presence of pre-existing antibodies or other serum factors in subject samples (Ross et al. 1990; Turano et al. 1992; Coutinho et al. 1995; Caruso and Turano 1997; van der Meide and Schellekens 1997; Boes 2000). Although pre-existing antibodies to a variety of endogenous proteins are present in healthy individuals, these can be much higher in some disease states. The sponsor should identify those samples with pre-existing antibodies (for example, through competition with drug) and remove them from the cut-point analysis.

시험대상자에게 기존 항체가 있는 경우, 투여 후 ADA가 증가한 대상자, 즉 치료 증강 ADA(treatment-boosted ADA)가 있는 대상자를 식별하기 위하여 개별 대상자의 노출 전후 결과 차이에 근거한 컷포인트를 사용하여 양성 반응을 판정하여야 할 수 있다. 치료 증강 ADA 반응을 평가하는 일반적인 접근 방법은 항체 역가의 변화를 평가하는 것이다. 앞서 IV.B항에서 설명한 방법을 컷포인트 설정에 사용할 수 없으면, 의뢰자는 FDA와 협의하여 대안 방법을 모색하여야 한다.

If subjects in the study have pre-existing antibodies, it may be necessary to assign positive responses using a cut-point based on the difference between individual subject results before and after exposure to identify subjects in whom ADA increases following treatment, also known as treatment-boosted ADA. A common approach to evaluating treatment-boosted ADA responses is to assess changes in antibody titers. If it is not possible to use the methods described earlier in section IV.B for establishing the cut-point, sponsors should consult with the Agency to explore alternative methods.

시험법 감도는 항체 조제물이 일관되게 양성 결과를 내거나 해당 시험법에서 정한 컷포인트와 같은 측정값을 내는 가장 낮은 농도이다. 시험법은 ADA가 약동학(PK), 약력학(PD), 안전성 또는 유효성 프로파일의 변화와 연관될 수 있는 수준에 이르기 전에 이를 검출할 수 있을 만큼 감도가 충분하여야 한다. 시험법 감도는 특정 대상자의 ADA 반응을 대표하지 않을 수 있는 양성대조 항체 조제물을 사용하여 평가한다. 예를 들어, 양성대조물질은 고친화성 항체가 농축되는 조건에서 개발되는 경우가 많다. 이러한 고친화성 양성대조물질은 시험법의 감도를 과대평가할 수 있다. 이 때문에 시험법 감도 측정은 어떤 대상자에서 검출될 ADA의 절대 질량을 정하기보다는 시험법이 어떻게 수행되는지를 전반적으로 이해하는 데 기여한다.

Assay sensitivity is the lowest concentration at which the antibody preparation consistently produces either a positive result or a readout equal to the cut-point determined for that assay. The assays should have sufficient sensitivity to enable detection of ADA before they reach levels that can be associated with altered pharmacokinetic (PK), pharmacodynamic (PD), safety, or efficacy profiles. Assay sensitivity is assessed using positive control antibody preparations that may not represent the ADA response in a specific subject. For example, positive controls are frequently developed under conditions that enrich for high affinity antibodies. Such high affinity positive controls may overestimate the sensitivity of the assay. Because of this, the assay sensitivity determination contributes to the overall understanding of how the assay performs rather than setting an absolute mass of ADA that will be detected in any given subject.

시험법 감도 측정은 체내에 남아 있는 약물(onboard drug)의 영향을 받을 수 있으므로, 예상되는 잔류 약물 농도가 있는 상태에서도 시험법 감도를 측정하는 것이 중요하다(IV.C.2항 참조).²⁰ FDA는 IgG 및 IgM ADA 선별시험과 확인시험이 적어도 100 ng/mL(nanograms per milliliter)의 감도를 달성할 것을 권고하지만, 위험성과 사전 지식에 따라 100 ng/mL보다 높은 감도 한계도 허용될 수 있다. 과거에 FDA는 적어도 250~500 ng/mL의 감도를 권고하였다. 그러나 최근 데이터에 따르면 100 ng/mL만큼 낮은 농도도 임상 사례와 연관될 수 있다(Plotkin 2010; Zhou et al. 2013). 중화시험은 그 수준의 감도를 달성하지 못할 수 있다는 점은 인정된다.

Because the measurement of assay sensitivity can be affected by onboard drug, it is also important to determine assay sensitivity in the presence of the expected concentration of onboard drug (see section IV.C.2).²⁰ FDA recommends that screening and confirmatory IgG and IgM ADA assays achieve a sensitivity of at least 100 nanograms per milliliter (ng/mL) although a limit of sensitivity greater than 100 ng/mL may be acceptable depending on risk and prior knowledge. Traditionally, FDA has recommended sensitivity of at least 250 to 500 ng/mL. However, recent data suggest that concentrations as low as 100 ng/mL may be associated with clinical events (Plotkin 2010; Zhou et al. 2013). It is understood that neutralization assays may not achieve that level of sensitivity.

IgE ADA를 평가하기 위해 개발한 시험법은 높은 pg/mL(picograms per milliliter)에서 낮은 ng/mL 범위의 감도를 가져야 한다.

Assays developed to assess IgE ADA should have sensitivity in the high picograms per milliliter (pg/mL) to low ng/mL range.

감도는 희석하지 않은 매트릭스(예: 혈장, 혈청, 타액) mL당 검출 가능한 항체 질량으로 표시하여야 한다. 시험법 감도를 역가로 보고해서는 안 된다. 시험법 감도는 최소 필요 희석배수(MRD)를 반영한 후 보고하여야 한다. 예를 들어, 감도가 50 ng/mL이고 MRD가 20인 시험법은 1000 ng/mL로 보고한다. 시험법 감도 시험은 임상 시료 시험에 사용할 것과 같은 생물학적 매트릭스를 해당 배수로 희석하여 수행하여야 한다. 예를 들어, 시험법 감도는 임상 시료에 사용하는 희석액과 같은 항응고제를 사용하여 측정하여야 한다.

The sensitivity should be expressed as mass of antibody detectable/mL of undiluted matrix; for example, plasma, sera, saliva. Assay sensitivity should not be reported as titer. Assay sensitivity should be reported after factoring in the minimal required dilution (MRD). For example, an assay with 50 ng/mL sensitivity and an MRD of 20 would be reported as 1000 ng/mL. Testing of assay sensitivity should be performed with the relevant dilution of the same biological matrix as will be used to test the clinical samples. For example, assay sensitivity should be determined using the same anticoagulant as the diluent used with clinical samples.

개발 중에는 투약 경험이 없는 대상자의 개별 또는 혼합 매트릭스를 사용하여 농도를 아는 양성대조 항체의 연속 희석액을 시험함으로써 감도를 평가할 수 있다. 희석 계열은 2배 또는 3배를 넘지 않아야 하며, 적어도 5개 희석 농도를 시험하여야 한다. 감도는 희석 곡선의 직선 구간을 시험법 컷포인트까지 내삽하여 계산할 수 있다.

During development, sensitivity may be assessed by testing serial dilutions of a positive control antibody of known concentration, using individual or pooled matrix from treatment-naïve subjects. The dilution series should be no greater than two- or threefold, and a minimum of five dilutions should be tested. The sensitivity can be calculated by interpolating the linear portion of the dilution curve to the assay cut-point.

시험법 감도를 매트릭스 mL당 질량 단위로 보고할 수 있도록, 시험법의 감도를 측정하는 양성대조물질로는 치료용 단백질 제품에 특이적인 항체의 정제 조제물을 사용하여야 한다. 감도 평가에 사용하는 양성대조 항체는 치료용 단백질 제품에 대해 친화 정제한 다클론 조제물이나 단클론항체(mAb)일 수 있다.

A purified preparation of antibodies specific to the therapeutic protein product should be used as the positive control to determine the sensitivity of the assay so that assay sensitivity can be reported in mass units/mL of matrix. Positive control antibodies used to assess sensitivity can take the form of polyclonal preparations affinity purified against the therapeutic protein product or monoclonal antibodies (mAb).

시험법을 일상적으로 수행할 때에는 저농도 양성 시스템 적합성 대조물질을 사용하여 시험 회차 전반에 걸쳐 시험법의 감도가 허용 가능한지 확인하여야 한다. 또한 저농도 양성대조물질은 선별 단계와 확인 단계 모두에서 일관되게 양성으로 나타나야 한다(IV.J.1항 참조). 양성대조물질과 음성대조물질은 IV.J.1항과 IV.J.2항에서 자세히 다룬다.

During routine performance of the assay, a low positive system suitability control should be used to ensure that the sensitivity of the assay is acceptable across assay runs. Additionally, the low positive control should be consistently demonstrated as positive in both screening and confirmatory tiers (see section IV.J.1). Both positive and negative controls are discussed in detail in sections IV.J.1 and IV.J.2.

혈청에 존재하는 치료용 단백질 제품이나 그 내재성 대응 단백질은 시험법의 감도를 방해할 수 있다. 간섭을 일으키는 치료용 단백질 제품이 예상 수준으로 존재하는 상태에서 시험법 감도를 평가하는 것, 즉 시험법의 약물 내성 평가는 투여받은 대상자에서 ADA를 검출하는 방법의 감도와 적합성을 이해하는 데 매우 중요하다.²¹ FDA는 의뢰자가 시험법 개발 초기에 시험법의 약물 내성을 조사할 것을 권고한다. 의뢰자는 치료용 단백질 제품이 ADA 검출을 방해하는지 판단하기 위해, 치료용 단백질 제품이 없거나 여러 양으로 있는 조건에서 ADA 음성 대조 시료에 양을 아는 양성대조 항체를 여러 수준으로 의도적으로 첨가하여 약물 내성을 조사할 수 있다. 해당 치료용 단백질 제품이 없을 때와 여러 양으로 있을 때 얻은 결과를 비교하여야 한다.

The therapeutic protein product or its endogenous counterpart present in the serum may interfere with the sensitivity of the assay. The assessment of assay sensitivity in the presence of the expected levels of interfering therapeutic protein product, also known as the assay’s drug tolerance, is critical to understanding the sensitivity and suitability of the method for detecting ADA in dosed subjects.²¹ FDA recommends that sponsors examine assay drug tolerance early in assay development. The sponsor may examine drug tolerance by deliberately adding different known amounts of positive control antibody into ADA-negative control samples in the absence or presence of different quantities of the therapeutic protein product to determine whether the therapeutic protein product interferes with ADA detection. Results obtained in the absence and presence of different quantities of the therapeutic protein product under consideration should be compared.

약물 내성은 순환하는 ADA-약물 복합체를 해리시키는 산 해리(acid dissociation) 같은 방법으로 개선할 수 있다. 시험법의 선택성, 표적의 성질, 양성대조물질의 유형은 약물 내성 평가에 영향을 주므로 시험법을 개발할 때 고려하여야 한다. 예를 들어, 항체가 산에 불안정하거나 약물 표적이 가용성인 경우에는 산 해리가 적절하지 않을 수 있다. 치료용 단백질 제품에 의한 간섭은 약물 최저 농도(trough) 시점에 대상자 시료를 채취하여 최소화할 수 있다. ADA 시료 채취 시기에 관한 권고사항은 VII.A항을 참조한다.

Drug tolerance may be improved using approaches such as acid dissociation that disrupt circulating ADA-drug complexes. The selectivity of the assay, the nature of the target, and the type of positive control should be taken into consideration when developing the assay because these factors impact the assessment of drug tolerance. For example, acid dissociation may not be appropriate when antibodies are acid labile or the drug target is soluble. Interference from the therapeutic protein product can be minimized by collecting subject samples at trough drug levels. See section VII.A for recommendations regarding the timing of ADA sample collection.

특이성은 방법이 목적 분석물질, 이 경우에는 ADA만을 검출하는 능력을 말한다.²² 시험법의 특이성이 부족하면 위양성 결과가 나올 수 있으며, 이는 ADA를 생성하는 면역반응과 약동학, 약력학, 임상 안전성 및 유효성 지표 사이의 관계를 흐릴 수 있다. 사람 혈청에는 Ig 농도가 높기 때문에 mAb, Fc 융합단백질, Ig 융합단백질에 대한 항체 반응의 특이성을 입증하는 데에는 어려움이 따른다. 시험법은 항-mAb 항체를 특이적으로 검출하되, mAb 제품 자체, 가용성 약물 표적, 비특이적 내재성 항체, 시험에 사용하는 항체 시약은 검출하지 않아야 한다. 마찬가지로, 류마티스 인자(RF) 발생률이 높은 대상자 집단의 경우 의뢰자는 RF가 검출 방법을 방해하지 않거나 시험법이 RF와 특이 항체를 구별할 수 있음을 입증하여야 한다.

Specificity refers to the ability of a method to exclusively detect the target analyte, in this case the ADA.²² Lack of assay specificity can lead to false-positive results, which could obscure relationships between ADA generating immune response, pharmacokinetics, pharmacodynamics, and clinical safety and efficacy measures. Demonstrating the specificity of antibody responses to mAb, Fc-fusion proteins, and Ig-fusion proteins poses challenges because of the high concentration of Ig in human serum. The assay should specifically detect anti-mAb antibodies but not the mAb product itself, soluble drug target, non-specific endogenous antibodies, or antibody reagents used in the assay. Similarly, for subject populations with a high incidence of rheumatoid factor (RF), the sponsor should demonstrate that RF does not interfere with the detection method or that the assay can differentiate between RF and specific antibodies.

RF는 IV.L.2항에서 자세히 다룬다. ADA가 숙주세포 단백질 및 그 밖의 제품 관련 불순물과 교차반응성을 보이는 경우, 이러한 반응의 특이성을 추가로 평가하여야 할 수 있다.

RF is discussed in detail in section IV.L.2. In cases where ADA demonstrates cross-reactivity with host cell proteins and other product-related impurities, the specificity of these reactions may need further evaluation.

특이성을 다루는 간단한 접근 방법은 가용성 또는 비표지 정제 치료용 단백질 제품으로 결합이 차단될 수 있음을 입증하는 것이다. 한 가지 접근 방법은 양성 및 음성 대조 항체 시료를 정제 치료용 단백질 제품이나 해당 구성 성분과 함께 배양하는 것이다. 관련 치료용 단백질 제품이나 그 구성 성분이 있을 때 신호가 억제되면 반응이 특이적임을 나타낸다. IgM 같은 다량체 항체의 특이성은 경쟁적 억제로 확립하기 어려울 수 있으므로, 이러한 경우 시험법의 능력을 확립하려면 신중한 개발이나 추가 접근 방법이 필요하다. mAb 제품에 대한 ADA의 경우, Fc는 같고 가변영역이 다른 다른 mAb를 포함하는 것이 유익할 수 있다.

A straightforward approach to addressing specificity is to demonstrate that binding can be blocked by soluble or unlabeled purified therapeutic protein product. One approach is to incubate positive and negative control antibody samples with the purified therapeutic protein product or its components under consideration. Inhibition of signal in the presence of the relevant therapeutic protein product or its components indicates that the response is specific. Establishing the specificity of multimeric antibodies such as IgM by competitive inhibition may be difficult, so establishing assay capability for these circumstances requires careful development or additional approaches. For ADA to mAb products, inclusion of another mAb with the same Fc but different variable region can be informative.

시험법이 연구 대상 치료용 단백질 제품에 대한 ADA에 특이적이고 선택적이라면, 일반적으로 그 치료용 단백질 제품이나 구성 성분을 용액 상태로 첨가하면 시험 신호가 감소한다. 반대로, 치료용 단백질 제품이나 구성 성분을 첨가해도 다른 특이성을 가진 항체에는 영향이 거의 없어야 한다.

If the assay is specific and selective for ADA to the therapeutic protein product being studied, generally the addition of that therapeutic protein product or its components in solution will reduce the assay signal. Conversely, addition of the therapeutic protein product or its components should have little effect on antibodies of other specificities.

ADA 시험법의 선택성은 시료 내 다른 성분이 있는 상태에서 치료용 단백질 제품에 특이적인 ADA를 식별하는 능력이다. 시험 결과는 매트릭스나 체내 잔류 치료용 단백질 제품의 간섭을 받을 수 있다. 대부분의 시험 매트릭스에는 크기와 전하가 다양한 단백질이 상당량 들어 있다는 점에 유의하는 것이 중요하다. 선택성을 확립하지 못하면 비특이적 신호가 생겨 양성 결과를 흐릴 수 있다.

The selectivity of an ADA assay is its ability to identify ADAs specific to the therapeutic protein product in the presence of other components in the sample. Assay results may be affected by interference from the matrix or onboard therapeutic protein product. It is important to note that most assay matrices contain significant amounts of proteins of various sizes and charges. Failure to establish selectivity can contribute to non-specific signal, thereby obscuring positive results.

중요한 고려사항은 시료 매트릭스(예: 혈장, 혈청, 타액)가 시험법 성능에 어떻게 영향을 줄 수 있는가이다. 희석액과 매트릭스에서의 시험법 성능을 비교할 때 어느 정도의 신호 억제는 예상된다. 매트릭스 내 내인성 및 외인성 성분은 시험 결과에 영향을 줄 수 있으며, 이러한 영향을 최소화하기 위해 대상자 시료를 희석하여 시험하는 것이 보통 필요하다. 의뢰자는 이 매트릭스가 시험 결과에 미칠 수 있는 간섭을 평가하는 밸리데이션 시험을 수행하기 전에, 대상자 시료 조제에 사용할 매트릭스와 희석배수를 정하여야 한다(MRD에 관해서는 IV.E.2항 참조).

An important consideration is how the sample matrix (for example, plasma, serum, saliva) can affect assay performance. Some degree of signal suppression is expected when comparing assay performance in diluent versus matrix. Endogenous and exogenous components in a matrix may influence assay results, and it is usually necessary to dilute subject samples for testing to minimize such effects. The sponsor should define the matrix and dilution factor that will be used for preparation of subject samples before performing validation studies assessing potential interference of this matrix on assay results (see section IV.E.2 on MRD).

유리 헤모글로빈(용혈), 지질(지질혈증), 빌리루빈(황달) 같은 매트릭스 내 여러 물질과 병용약물의 존재는 시험 결과를 방해할 수 있다. 예를 들어, 시료 채취 시 사용하는 항응고제는 시험법에 서로 다른 영향을 미쳐 시험법 감도에 영향을 줄 가능성이 있다. 의뢰자는 매트릭스가 있거나 없는 조건에서 양을 아는 양성대조 항체를 여러 수준으로 스파이킹하여 매트릭스 간섭을 조사할 수 있다. 완충액만 있을 때와 매트릭스에서의 ADA 회수율을 비교하면 매트릭스 성분에 의한 간섭 정도에 관한 정보를 얻을 수 있다. 나아가 이러한 분석은 시료 시험에 권장되는 MRD를 결정하는 데 지침이 될 수 있다. 이 정보는 시험법 감도를 이해하는 데 유용할 수 있다.

Various substances in the matrix, such as free hemoglobin (hemolysis), lipids (lipemia), bilirubin (interus), and presence of concomitant medications, can interfere with assay results. For example, the anticoagulants used during sample collection may have different effects on the assay, potentially affecting the assay sensitivity. The sponsor may examine matrix interference by spiking different known amounts of positive control antibodies in the presence or absence of matrix. Comparing the recovery of ADA in buffer alone with that in the matrix can provide input on the degree of interference from matrix components. Furthermore, such analysis may guide decisions on the MRD recommended for sample testing. This information may be useful to understanding assay sensitivity.

치료용 단백질 제품과 화학적으로 관련된 완충액 성분도 시험에서 간섭을 일으킬 수 있다. 예를 들어, 폴리소르베이트는 폴리에틸렌글리콜(PEG)과 화학적으로 비슷하므로 항-PEG 항체 검출을 방해할 수 있다. 시험법 개발 중에는 완충액의 화학 조성을 신중히 고려하여야 한다.

Buffer components that are chemically related to the therapeutic protein product may also cause interference in the assay. For example, polysorbate is chemically similar to polyethylene glycol (PEG) and therefore may interfere in the detection of anti-PEG antibodies. The chemical composition of the buffer should be carefully considered during assay development.

매트릭스 성분은 비특이적 신호를 일으켜 양성 결과를 흐릴 수 있다. 따라서 ADA를 검출하는 합리적인 능력을 유지하기 위해 대상자 시료를 희석해야 하는 경우가 많다. MRD에 대해서는 신호 대 잡음비가 가장 높은 시료 희석배수, 시험 희석액에 가장 가까운 신호를 내는 시료 희석배수, 신호 대 변동성 비가 가장 높은 시료 희석배수 등 여러 정의가 제안되어 왔다(Mire-Sluis et al. 2004).²³ 의뢰자는 이 정의 중 어느 것이든 사용할 수 있지만, 시험법 감도와 역가를 계산할 때 MRD는 시험에서 시료의 최종 희석배수를 고려하여야 하며, 이는 보통 1:5에서 1:100(즉, 1/5에서 1/100) 범위이다.

Matrix components can contribute to non-specific signal, thereby obscuring positive results. Therefore, there is frequently a need to dilute subject samples to maintain a reasonable ability to detect ADA. Multiple definitions of MRD have been proposed, including the sample dilution that yields the highest signal-to-noise ratio; the sample dilution that results in a signal closest to assay diluent; and the sample dilution that results in the highest signal to variability ratio (Mire-Sluis et al. 2004).²³ Sponsors may use any of these definitions, but for the purposes of calculating assay sensitivity and titer, the MRD should take into consideration the final dilution of the sample in the assay, which typically ranges from 1:5 to 1:100 (that is, 1/5 to 1/100).

FDA는 의뢰자가 투약 경험이 없는 대상자에서 얻은 적절한 수의 시료 패널로 MRD를 정할 것을 권고한다. MRD를 정하는 과정에는 보통 투약 경험이 없는 ADA 음성 시료를 연속 희석하는 것과 함께, 양을 아는 정제 항체를 고·중·저 농도로 연속 희석한 매트릭스에서 시험하여 희석액 중 같은 양의 양성대조 항체와 비교하는 것이 포함된다. 이렇게 하면 시험법 범위 전체에서 합리적인 신호 대 잡음비가 보장된다. MRD는 적절한 수의 개별 혈청 시료를 사용하여 계산하여야 한다. 적절한 시료 수는 개별 시료의 변동성 등 여러 요인에 따라 달라지지만, 적어도 10개 시료가 흔히 권장된다(Mire-Sluis et al. 2004).²⁴

FDA recommends that sponsors determine the MRD from a panel of appropriate number of samples from treatment-naïve subjects. Determination of MRD usually involves serially diluting treatment-naïve ADA-negative samples, as well as testing known amounts of purified antibody at high, medium, and low concentrations in serially diluted matrix in comparison to the same amount of positive control antibody in diluent. This ensures a reasonable signal-to-noise ratio throughout the range of the assay. The MRD should be calculated using an appropriate number of individual serum samples. The appropriate number of samples will depend on various factors, including the variability of the individual samples; however, at least 10 samples are frequently recommended (Mire-Sluis et al. 2004).²⁴

의뢰자가 최종적으로 선택하는 MRD는 시험법 설계와 대상자 집단에 따라 달라지지만, FDA는 MRD가 1:100을 넘지 않을 것을 권고한다. MRD가 더 높으면 위음성 반응이 나올 수 있다. 그러나 일부 경우에는 더 높은 MRD가 필요할 수 있으며, 이때 그러한 MRD가 시험법 감도와 면역원성 위험성 평가에 미치는 전반적 영향을 고려하여야 한다.

Although the MRD ultimately selected by the sponsor will depend on the assay design and subject population, FDA recommends that MRD not exceed 1:100. Higher MRD may result in false-negative responses. However, in some instances higher MRD may be required, and the overall effect of such MRD on assay sensitivity and immunogenicity risk assessment should be considered.

정밀성은 같은 물질을 한 방법으로 일련의 측정을 했을 때의 변동성 척도이다. 적절한 정밀성을 보장하려면 결과가 시험 회차 내와 회차 간에 재현 가능하여야 한다.²⁵ 시험법 변동성은 컷포인트를 정하고 저농도 양성 시료가 양성으로 검출되도록 보장하는 근거이므로, 시험법 정밀성 입증은 ADA 평가에 매우 중요하다. 신뢰할 수 있는 추정값을 얻으려면 의뢰자는 시험 반응의 시험 내(반복성) 변동성과 시험 간(중간 정밀성) 변동성을 모두 평가하여야 한다. 변동 컷포인트(floating cut-point)가 필요한 경우 시험 간 정밀성은 정규화된 값으로 계산할 수 있다.

Precision is a measure of the variability in a series of measurements for the same material run in a method. Results should be reproducible within and between assay runs to assure adequate precision.²⁵ Demonstrating assay precision is critical to the assessment of ADA because assay variability is the basis for determining the cut-points and ensuring that low positive samples are detected as positive. To provide reliable estimates, the sponsor should evaluate both intra-assay (repeatability) and inter-assay (intermediate precision) variability of assay responses. In cases where a floating cut-point is needed, inter-assay precision may be calculated using normalized values.

재현성은 한 연구 동안 둘 이상의 독립된 시험실에서 시험법을 수행할 경우 중요한 고려사항이며, 의뢰자는 각 시험실에서 산출한 데이터의 비교 가능성을 확립하여야 한다.²⁶ 감도, 약물 내성, 정밀성을 포함한 시험법 성능이 시험실 간에 비교 가능함을 확립하여야 한다.

Reproducibility is an important consideration if an assay will be run by two or more independent laboratories during a study, and a sponsor should establish the comparability of the data produced by each laboratory.²⁶ Comparable assay performance, including sensitivity, drug tolerance, and precision, should be established between laboratories.

시험법 완건성은 정상 사용 중 시험법의 신뢰성을 나타내는 것으로,²⁷ 일상적인 시험실 업무에서 실제 상황에서 예상되는 방법 및 기기 성능의 작지만 의도적인 변동에 시험법이 영향을 받지 않고 유지되는 능력으로 평가한다. 예를 들어, 온도, 배양 시간, 또는 pH와 염 농도 같은 완충액 특성의 변화는 모두 시험 결과에 영향을 줄 수 있다. 생물학적 시험법(bioassay)은 복잡하기 때문에 시험 조건의 변동에 특히 민감하며, 세포 계대수, 배양 시간, 배양 배지 성분 같은 변수를 평가하고 최적화하는 것이 필수적이다. 의뢰자는 개발 단계에서 완건성을 조사하여야 하며, 시험법의 특정 단계에서 작은 변화가 결과에 영향을 준다면 그 단계를 관리하기 위한 예방 조치를 취하여야 한다.

Assay robustness is an indication of the assay’s reliability during normal usage²⁷ and is assessed by the capacity of the assay to remain unaffected by small but deliberate variations in method and instrument performance that would be expected under relevant, real-life circumstances in routine laboratory practice. For example, changes in temperature, incubation times, or buffer characteristics such as pH and salt concentration can all impact assay results. The complexity of bioassays makes them particularly susceptible to variations in assay conditions, and it is essential to evaluate and optimize parameters such as cell passage number, incubation times, and culture media components. The sponsor should examine robustness during the development phase, and if small changes in specific steps in the assay affect results, precautions should be taken to control that step.

완건성의 일부 측면은 시험법 밸리데이션 작업에 포함할 수 있다(VI.A항 참조). 대상자 시료의 안정성을 확립하는 것은 일반적으로 가능하지 않으므로, FDA는 시험 시점에 항체 반응성이 유지되는 방식으로 대상자 시료를 보관할 것을 권고한다. 이러한 시료의 동결과 해동도 시험 결과에 영향을 줄 수 있으므로, FDA는 의뢰자가 대상자 시료를 적절히 소분하여 동결-해동 횟수를 최소화할 것을 권고한다. 그러나 양성대조 항체의 단기 안정성, 즉 해당하는 경우 동결-해동 주기 안정성과 냉장 및 실온 안정성을 평가하는 시험은 유용할 수 있다.

Some aspects of robustness may be included in the assay validation exercise (see section VI.A). Because it is generally not feasible to establish the stability of subject samples, FDA recommends storing subject samples in a manner that preserves antibody reactivity at the time of testing. FDA recommends that sponsors minimize freeze-thaw cycles by appropriately aliquoting subjects’ samples because freezing and thawing such samples may also affect assay results. However, studies evaluating short-term stability, including, as relevant, freeze-thaw cycle and refrigerator- and room-temperature stability of positive control antibodies, may be useful.

ADA 검출에 사용할 수 있는 다양한 시험 형식과 기기가 있다. 여기에는 직접 결합 시험, 브리지 시험, 액상 결합 시험(예: 방사면역침강법) 등이 있으며, 이에 국한되지 않는다. 각 시험 형식에는 처리량, 감도, 선택성, 동적 범위, 다양한 Ig 아이소타입 검출 능력, 빠르게 해리되는 항체 검출 능력, 시약 확보 가능성 등 장단점이 있다. 항원(예: PEG)에 반복 모티프가 있으면 브리지 시험 형식은 위음성 결과를 낼 수 있다. 이들 시험 형식의 주요 차이 중 하나는 세척 횟수와 강도이며, 이는 시험법 감도에 영향을 줄 수 있다.

Different assay formats and instrumentation are available that can be used for detection of ADA. These include, but are not limited to, direct binding assays, bridging assays, and soluble-phase binding assays; for example, radioimmunoprecipitation assay. Each assay format has advantages and disadvantages, including throughput, sensitivity, selectivity, dynamic range, ability to detect various Ig isotypes, ability to detect rapidly dissociating antibodies, and availability of reagents. Bridging assay formats may be subject to false-negative results when the antigen (for example, PEG) has repetitive motifs. One of the major differences between these assay formats is the number and vigor of washes, which can influence assay sensitivity.

플라스틱에 결합하거나 다른 물질(예: 형광색소, 효소 또는 비오틴 리포터)과 결합하면 항원의 입체구조가 변하여 해당 치료용 단백질 제품의 관련 항체 결합 부위가 가려지거나, 노출되거나, 변형되거나, 파괴될 수 있으므로 에피토프 노출도 고려하는 것이 중요하다.

Epitope exposure is also important to consider because binding to plastic or coupling to other agents (for example, fluorochrome, enzyme, or biotin reporters) can result in conformational changes of the antigen that can obscure, expose, modify, or destroy relevant antibody binding sites on the therapeutic protein product in question.

ADA 검출 시험법의 여러 구성 요소는 표준품이거나 상업적 공급원에서 구할 수 있다(예: 마이크로타이터 플레이트). 그러나 양성대조 항체, 음성대조물질, 시스템 적합성 대조물질 등 다른 구성 요소는 해당 시험법을 위해 특별히 제조해야 할 수 있다. 핵심 시약의 적격성 평가와 안정성은 일관된 시험법 성능을 보장하는 데 중요하다.

Many components of the assays for ADA detection may be standard or obtained from commercial sources; for example, microtiter plates. Other components, however, including positive control antibodies, negative controls, and system suitability controls, may need to be generated specifically for the assay. Qualification and stability of critical reagents is important for ensuring consistent assay performance.

의뢰자는 시험법 개발, 밸리데이션, 그리고 일상적 시험법 성능 평가 중 시스템 적합성 모니터링에 같은 양성대조 항체를 사용하거나 서로 다른 양성대조 항체를 사용할 수 있다. 시스템 적합성 대조물질로는 시험법 감도를 보장하고 후크 효과(hook effect)를 검출하도록 조정한 농도로 사용하는 단클론 또는 다클론 양성대조 항체를 포함하여야 한다.²⁸

Sponsors may use the same or different positive control antibodies to develop, validate, and monitor system suitability during routine assessment of assay performance. For system suitability controls, a positive control antibody, either mono- or polyclonal, used at concentrations adjusted to ensure assay sensitivity and detect hook effects, should be included.²⁸

양성대조물질을 만드는 데에는 여러 접근 방법을 사용할 수 있다. 가장 흔하게는 보조제 없이 또는 보조제와 함께 동물을 면역하여 양성대조 항체를 만든다. FDA는 동물 면역으로 만든 양성대조 항체를 치료용 단백질 제품으로 친화 정제할 것을 권고한다. 이 접근 방법은 다클론 항체 조제물에서 ADA를 농축하므로 감도 평가 결과를 더 잘 해석할 수 있게 한다. 양성대조 항체를 만들 때 동물 종의 선택은 신중히 고려하여야 한다. 예를 들어, 대상자의 항체를 검출하는 2차 시약으로 항-사람 Ig 시약을 사용할 경우, 양성대조 항체와 정도관리(QC) 시료도 이상적으로는 같은 시약으로 검출할 수 있어야 한다.

Different approaches may be used to generate a positive control. Most frequently, positive control antibodies are generated by immunizing animals in the absence or presence of adjuvants. FDA recommends that positive control antibodies generated by immunizing animals be affinity purified using the therapeutic protein product. This approach enriches the polyclonal antibody preparation for ADA, which enables a better interpretation of sensitivity assessment results. The selection of animal species when generating positive control antibodies should be carefully considered. For example, if an anti-human Ig reagent will be used as a secondary reagent to detect antibodies in subjects, the positive control antibodies and quality control (QC) samples ideally should be detectable by that same reagent.

양성대조 항체가 같은 시약으로 검출되지 않는 경우(예: 양성대조물질을 토끼에서 만들어 이를 검출하는 데 다른 2차 시약이 필요한 경우), 대상자 시료의 사람 항체를 검출하는 데 사용하는 2차 시약이 예상대로 작동하는지 확인하기 위하여 그 2차 시약에 대한 양성대조 항체도 시험에 포함하여야 한다. 일부 경우에는 의뢰자가 대상자 시료에서 양성대조 항체를 만들 수 있다.²⁹ 이러한 대상자 유래 양성대조물질은 매우 가치가 있을 수 있지만, 일반적으로 초기 임상시험에서는 확보할 수 없다. 또는 개별 mAb나 mAb 패널을 양성대조 항체로 사용할 수 있다. 치료용 mAb의 경우, 의뢰자는 치료용 mAb의 가변영역에 결합하는 양성대조 항체를 선택하여야 한다.

When the positive control antibody is not detectable by that same reagent (for example, if the positive control is generated in a rabbit and a different secondary reagent is needed to detect the positive control antibody), a positive control antibody for the secondary reagent used to detect human antibodies in the subject samples also should be included in the assay to ensure that the reagent performs as expected. In some instances, the sponsor may be able to generate a positive control antibody from subjects’ samples.²⁹ Such subject-derived positive controls can be very valuable but are generally not available in early trials. Alternatively, individual mAb or panels of mAb may be used as positive control antibodies. For therapeutic mAb, the sponsor should select a positive control antibody that binds to the variable region of the therapeutic mAb.

드물게 의뢰자가 양성대조 항체를 만들 수 없는 경우, 의뢰자는 시험법 개발 및 밸리데이션의 대안 접근 방법을 FDA와 협의하여야 한다.

Sponsors should discuss with FDA alternative approaches to assay development and validation in the rare event that a sponsor is not able to generate a positive control antibody.

양성대조 항체의 공급원이 정해지면, 의뢰자는 그 공급원을 사용하여 감도, 선택성, 특이성, 약물 내성, 재현성 같은 시험법 성능 특성을 평가하여야 한다. FDA는 의뢰자가 일상적 시험 수행 중 정도관리 또는 시스템 적합성 대조물질로 사용할 양성대조 항체를 만들어 확보해 둘 것을 권고한다. 시험법 개발과 밸리데이션을 위해서는 희석액이 높은, 중간, 낮은 시험 신호값을 내야 한다. 중간값은 시험법 밸리데이션 중 정밀성을 평가하는 데 유용하다. 이는 넓은 범위의 항체 농도에서 시험법 성능이 허용 가능한지 이해하기 위하여 정성 시험법을 개발할 때에도 권장된다. 일상적 시험 수행 중 시스템 적합성을 모니터링하는 데에는 일반적으로 ADA 검출용 중간값 QC 시료가 필요하지 않다.

Once a source of a positive control antibody has been identified, the sponsor should use that source to assess assay performance characteristics such as sensitivity, selectivity, specificity, drug tolerance, and reproducibility. FDA recommends that sponsors generate and reserve positive control antibody for use as a quality control or system suitability control during routine performance of the assay. For assay development and validation, dilutions should generate high, intermediate, and low assay signal values. The intermediate value is useful for assessing precision during assay validation. This is recommended even for development of qualitative assays to understand whether assay performance is acceptable across a broad range of antibody concentrations. Intermediate-value QC samples for detection of ADA are generally not needed for monitoring system suitability during routine assay performance.

FDA는 의뢰자가 밸리데이션 시험과 대상자 시료 시험을 위한 음성대조물질을 확립할 것을 권고한다. 이와 관련하여, 투약 경험이 없는 적절한 수의 대상자에게서 얻은 혈청을 혼합한 것을 음성대조물질로 사용할 수 있다. 중요한 점은, 음성대조물질에서 얻은 값은 시험 대상 집단에서 그 시험법에 대해 정한 컷포인트보다 낮되 이에 가까워야 한다는 것이다. 컷포인트 설정에 사용한 개별 혈청 시료에서 도출한 평균값보다 훨씬 낮은 값을 내는 음성대조물질은 적절한 시험법 성능을 보장하는 데 유용하지 않을 수 있다.

FDA recommends that sponsors establish a negative control for validation studies and subject-sample testing. In this regard, a pool of sera from an appropriate number of treatment-naïve subjects can serve as a negative control. Importantly, the value obtained for the negative control should be below but close to the cut-point determined for the assay in the subject population being tested. Negative controls that yield values far below the mean value derived from individual serum samples used to establish the cut-point may not be useful in ensuring proper assay performance.

가능하면 음성대조 시료는 연구 대상 질환을 가진 투약 경험이 없는 대상자에게서 채취하여야 하며, 시료 매트릭스가 연구 집단을 대표하도록 성별, 연령, 병용약물이 비슷한 대상자를 포함하여야 한다. 이러한 분석 전 변수는 시험에서 대조 시료의 성능에 영향을 줄 수 있으므로, 대조 시료는 예를 들어 사용한 항응고제의 종류, 용량, 시료 조제 및 보관 측면에서 연구 시료와 같은 방식으로 채취하고 취급하여야 한다. 개발 단계나 연구 전 밸리데이션 작업 중에는 이러한 대조 시료를 사용할 수 없는 경우가 많다. 이러한 상황에서는 구매한 시료나 건강한 공여자의 시료를 사용해도 되지만, 적절한 표적 집단의 투약 경험이 없는 대상자 시료를 확보하게 되면 컷포인트, 감도, 선택성 같은 시험법 성능의 중요 변수를 확인하여야 한다.

When possible, negative control samples should be collected from treatment-naïve subjects with the medical condition being studied and should include subjects with similar sex, age, and concomitant medications so that the sample matrix is representative of the study population. Control samples should be collected and handled in the same manner as study samples with respect to, for example, type of anticoagulant used, volume, and sample preparation and storage because these pre-analytical variables can impact the performance of control samples in the assay. It is frequently the case that such control samples are not available for use during development or pre-study validation exercises. In those situations, it is acceptable to use purchased samples or samples from healthy donors, but important parameters of assay performance such as cut-point, sensitivity, and selectivity should be confirmed when samples from treatment-naïve subjects from the appropriate target population become available.

서로 다른 집단의 음성대조물질을 사용할 때 컷포인트와 선택성이 다르면, 다른 시험법 변수(예: 감도)를 재평가하여야 할 수 있다.

If cut-point and selectivity differ when negative controls from different populations are used, re-evaluating other assay parameters (for example, sensitivity) may be needed.

마이크로타이터 플레이트의 플라스틱부터 발색 시약까지 모든 시험 구성 요소는 시험법 감도와 비특이적 결합에 영향을 줄 수 있다. 가장 중요한 요소 중 하나는 비특이적 결합을 막는 데 사용하는 적절한 시험 완충액과 블로킹 시약을 선택하는 것이다. 의뢰자는 감도를 유지하면서 바탕 잡음을 줄이기 위해 세척 단계의 횟수와 시기, 그리고 시험 완충액(예: 블로킹 또는 세척 완충액)에 첨가하는 계면활성제를 신중히 고려하여야 한다. 허용 가능한 신호 대 잡음비를 얻기 위해 다양한 단백질을 블로킹 시약으로 사용할 수 있다. 그러나 이 단백질들이 특정 면역시험에서 모두 동등하게 작동하지는 않을 수 있다. 예를 들어, 모든 종류의 고상(solid phase)에 잘 결합하지 않거나 검출 시약과 예상하지 못한 교차반응성을 보일 수 있다.

Every test component, from the plastic of the microtiter plates to the developing agent, can affect assay sensitivity and non-specific binding. One of the most critical elements is the selection of the proper assay buffer and blocking reagents used to prevent non-specific binding. The sponsor should carefully consider the number and timing of wash steps as well as the detergents added to the assay buffer (for example, blocking or wash buffer) to reduce background noise while maintaining sensitivity. A variety of proteins can be used as blocking reagents to provide acceptable signal-to-noise ratio. However, these proteins may not all perform equivalently in specific immunoassays. For example, they may not bind well to all types of solid phases or may show unexpected cross-reactivity with the detecting reagent.

따라서 의뢰자는 시험법 성능을 최적화하기 위해 여러 블로킹 물질을 시험하여야 할 수 있다. 또한 코팅하지 않은 웰을 포함하는 것만으로는 비특이적 결합을 평가하기에 충분하지 않다. 그보다는 시료에 존재할 수 있는, 크기와 전하가 비슷한 관련 없는 단백질에 ADA가 결합하는 능력을 측정하는 것이 결합 특이성을 더 잘 시험하는 방법이 될 수 있다.

Therefore, the sponsor may need to test several blocking agents to optimize assay performance. Moreover, including uncoated wells is insufficient to assess non-specific binding. Rather, determining the capacity of ADAs to bind to an unrelated protein of similar size and charge that may be present in the sample may prove to be a better test of binding specificity.

양성 항체 반응을 보고하는 데에는 여러 접근 방법을 사용할 수 있으며, 사용한 접근 방법의 적절성은 사안별로 평가하여야 한다. 가장 일반적인 접근 방법은 정성적인 것으로, 대상자를 항체 반응 양성 또는 음성으로 보고한다.

Several approaches may be used to report positive antibody responses, and the appropriateness of the approach used should be evaluated on a case-by-case basis. The most common approach is qualitative, with subjects reported as having a positive or negative antibody response.

ADA 양성으로 확인된 대상자의 경우, 항체 수준을 측정하면 ADA와 그것이 안전성 및 유효성에 미치는 영향을 층화하여 평가할 수 있으므로 유익할 수 있다. 양성 항체 수준은 역가를 사용하여 평가할 수 있다. 항체 수준을 역가로 보고하는 것은 적절하며 의료계에서 일반적으로 이해된다. 역가는 시험법 컷포인트와 같거나 바로 위의 값을 내는 가장 높은 희석배수의 역수로 정하는 경우가 가장 많다. 또는 용량-반응 곡선의 직선 구간을 사용하여 희석배수를 시험법 컷포인트까지 외삽하여 역가를 정할 수 있다. MRD와 산 해리 같은 모든 시료 희석은 역가 계산에 반영하여야 하며, 역가를 보고할 때 함께 제시하여야 한다.

For subjects who are confirmed to be ADA positive, determining antibody levels can be informative because it allows for stratified assessment of ADAs and their impact on safety and efficacy. Positive antibody levels may be evaluated using a titer. Reporting levels of antibodies in terms of titers is appropriate and generally understood by the medical community. Most frequently titer is determined from the reciprocal of the highest dilution that gives a value at or just above the cut-point of the assay. Alternatively, titer may be determined by extrapolating the dilution to the assay cut-point using the linear portion of the dose response curve. All sample dilutions, such as the MRD and acid dissociations, should be factored into the calculations of titers and provided when reporting titers.

중화시험 결과를 보고할 때에는 혈청 부피당 중화된 치료용 단백질 제품의 질량 단위 양으로도 값을 보고할 수 있으나, 이 값은 임의의 시험관내 시험 단위이며 치료용 단백질 제품의 생체내 이용 가능성을 추정하는 데 사용할 수 없다는 단서가 붙는다.

When reporting results for neutralization assays, values may also be reported as amount of mass units of therapeutic protein product neutralized per volume serum with the caveat that these are arbitrary in vitro assay units and cannot be used to estimate in vivo availability of the therapeutic protein product.

사용한 시험방법이 희석하지 않은 매트릭스의 부피당 질량을 독립적으로 측정할 수 있는 경우가 아니라면, 질량 단위로 보고한 항체 수준은 일반적으로 허용되지 않는다. 이는 질량 단위 추정값이 양성대조 항체로 만든 표준곡선 데이터의 내삽에 근거하며, 양성대조물질과 시험 물질 사이의 평행성을 가정할 수 없기 때문이다. 나아가 양성대조물질과 시험 물질 사이의 평행성이 입증되더라도, 시료에는 서로 다른 항체 집단이 들어 있을 가능성이 높으므로 절대 질량 단위를 정확히 계산할 수 없다.

Unless the assay method used allows for independent determination of mass per volume of undiluted matrix, antibody levels reported in mass units are generally not acceptable. This is because the mass unit estimations are based on interpolation of data from standard curves generated with a positive control antibody, and parallelism between the positive control and test article cannot be assumed. Furthermore, even if parallelism between the positive control and test article is demonstrated, the absolute mass units cannot accurately be calculated because the samples are likely to contain different populations of antibodies.

따라서 FDA는 (1) 결과를 정량적 방법으로 측정하였거나 (2) 보편적으로 인정되고 입수 가능한 밸리데이션된 항체 공급원을 대조물질로 사용할 수 있고 대조 항체와 대상자 시료의 희석 곡선 사이의 평행성이 입증된 경우가 아니라면, 의뢰자가 대상자 항체 결과를 질량 단위로 보고하는 것이 필요하거나 바람직하다고 보지 않는다.

Thus, FDA does not consider it necessary or desirable for the sponsor to report subject antibody results in terms of mass units unless (1) the results are determined by quantitative means or (2) a universally accepted and accessible source of validated antibody is available as a control and parallelism between the dilution curves of the control antibody and subject samples has been demonstrated.

대상자 시료의 변동성, 세포 기반 중화 생물학적 시험에서 표준곡선 작성에 사용하는 세포의 치료용 단백질 제품 용량-반응, ADA의 친화성(affinity)과 결합력(avidity), 확인시험에서 경쟁 제품의 농도 등 수많은 요인이 ADA 수준 평가에 영향을 줄 수 있다. 이러한 요인을 고려하는 것은 시험법 변동성을 이해·분석하고 오류를 피하는 데 중요하다. 고려하여야 할 일반적인 요인은 다음과 같다.

A myriad of factors can affect the assessment of ADA levels, such as subject-sample variability; therapeutic protein product-dose response of the cells used to generate the standard curve in a cell-based neutralization bioassay; affinity and avidity of the ADA; and concentration of competing product in confirmatory assays. Accounting for such factors is important to understand and analyze assay variability and avoid errors. Common factors that should be considered include the following:

기존 항체는 시험 중인 치료용 단백질 제품의 유효성에 영향을 주는 임상적 영향을 미칠 수 있다. 기존 항체가 있는 경우 ADA의 양과 질을 평가하려면 정성 선별시험 접근 방법을 대신할 방법이 필요할 수 있다. 예를 들어, 역가시험(V.C항 및 VI.D항 참조) 같은 반정량 시험법으로 시료의 ADA 증가를 시험하면, 정성 시험법으로는 얻을 수 없는, 치료용 단백질 제품이 제품 면역원성에 미치는 영향에 관한 정보를 얻을 수 있다. 기존 항체가 있고 치료용 단백질 제품에 노출된 후 항체 역가가 증가하면, 이를 치료 유도 항체 역가와 구별하기 위해 치료 증강(treatment-boosted)으로 보고할 수 있다. 예를 들어, 2배 희석으로 역가를 정하는 경우, 증강 ADA 반응은 투여 전 역가보다 희석 2단계 높은 역가로 정의할 수 있다.

Pre-existing antibodies may have clinical effects that affect the efficacy of the therapeutic protein product being tested. An alternative to the qualitative screening assay approach may be needed to assess the quantity and quality of ADA when pre-existing antibodies are present. For example, testing samples for an increase in ADA using a semi-quantitative assay such as a titration assay (see sections V.C and VI.D) can provide information on the impact of a therapeutic protein product on product immunogenicity that is not provided by a qualitative assay. When there are pre-existing antibodies and the titer of antibodies increases after exposure to the therapeutic protein product, they can be reported as treatment-boosted to differentiate them from treatment-induced antibody titers. For example, a boosted ADA response may be defined as a titer that is two dilution steps greater than the pre-treatment titer, when twofold dilutions are used to determine the titer.

mAb나 Fc 융합단백질처럼 Fc 영역을 가진 치료용 단백질 제품에 대한 면역반응을 측정하는 것은 매트릭스에 RF가 있으면 특히 어려울 수 있다. RF는 일반적으로 IgG를 인식하는 IgM 항체이지만, 다른 Ig 특이성을 가진 RF도 보고되어 있다. 따라서 RF는 Fc 영역에 결합하여, 치료용 단백질 제품에 대한 특이 항체가 있는 것처럼 보이게 한다. 아스파탐 처리(Ramsland et al. 1999), 그리고 바탕 결합을 줄이도록 시약 농도를 신중히 최적화하는 것 등 RF 간섭을 최소화하는 여러 접근 방법이 유용한 것으로 입증되었다. 개발 중 RF가 위양성 결과를 일으키는 임상 상황에서 Fc 융합단백질에 대한 면역반응을 조사할 때, FDA는 온전한 생물치료제 전체가 아닌 단백질의 비-Fc 영역에 특이적인 시험법을 개발할 것을 권고한다.

Measuring immune responses to therapeutic protein products that possess Fc regions, such as mAb and Fc-fusion proteins, may be particularly difficult when RF is present in the matrix. RF is generally an IgM antibody that recognizes IgG, although other RF Ig specificities have been noted. Consequently, RF will bind Fc regions, making it appear that specific antibody to the therapeutic protein product exists. Several approaches for minimizing interference from RF have proven useful, including treatment with aspartame (Ramsland et al. 1999) and careful optimization of reagent concentrations so as to reduce background binding. When examining immune responses to Fc-fusion proteins in clinical settings where RF generates false-positive results during development, FDA recommends developing an assay specific for the non-Fc region of the proteins rather than against the intact biotherapeutics.

키메라화와 인간화처럼 mAb의 비인간 서열을 줄이는 기술로 ADA는 줄었지만 없어지지는 않았다. 이 경우 면역반응은 주로 mAb의 가변영역을 향한다(Harding et al. 2010; van Schouwenburg et al. 2014). 가변영역에 대한 반응성을 검출할 수 있는 시험법이 mAb 기반 치료제에 대한 항체가 대상자에게 미칠 수 있는 영향을 평가하는 데 더 적절한 것으로 본다. Fc 영역이 조작되었거나 다른 분자와 결합되어 있으면, 이에 대한 반응을 특성분석하는 시험법이 필요할 수 있다.

Technologies reducing the presence of non-human sequences in mAb, such as chimerization and humanization, have reduced but not eliminated ADA. In these cases, the immune responses are directed largely against the variable regions of the mAb (Harding et al. 2010; van Schouwenburg et al. 2014). The assays that can detect the reactivity against variable regions are considered more appropriate to evaluate the potential impact of antibodies against mAb-based therapeutics in subjects. If the Fc region is engineered or bound to another molecule, an assay that characterizes this response may be needed.

항체-약물 접합체(ADC)는 저분자 약물이 접합된 항체이므로 전형적인 합텐-운반체 분자에 해당한다. 따라서 면역원성 시험법은 항체, 링커-약물, 접합으로 생길 수 있는 새로운 에피토프를 포함하여 ADC 치료용 단백질 제품의 모든 구성 요소에 대한 반응을 측정하여야 한다. 면역원성 시험을 위해 ADC를 표지해야 하는 경우, 표지된 분자의 소수성이 증가하면 응집을 일으킬 수 있으므로 접합 시 이 가능성을 고려하여야 한다. 이러한 포획 시약의 안정성과 용해도는 적절히 특성분석하여야 한다(IV.A.3항 참조).

Antibody-drug conjugates (ADCs) are antibodies conjugated with small molecule drugs, so they represent a classic hapten-carrier molecule. Therefore, the immunogenicity assays should measure the responses to all components of the ADC therapeutic protein product, including the antibody, linker-drug, and new epitopes that may result from conjugation. When ADCs need to be labeled for immunogenicity assays, the conjugation should consider the potential for increased hydrophobicity of the labeled molecules because they may cause aggregation. The stability and solubility of these capture reagents should be adequately characterized (see section IV.A.3).

각 시험법 유형의 개발에 관한 구체적인 정보는 아래 A항부터 D항까지에 제시되어 있다. 이 항들은 모든 시험법 유형에 관련된 IV항의 정보를 보완한다.

Information specific to the development of respective assay types is provided in sections A through D below. These sections supplement the information provided in section IV that is relevant to all assay types.

앞서 IV.A항에서 논의한 다단계 접근 방법에 따라, ADA 검출에 처음 사용하는 시험법은 저친화성 및 고친화성 ADA를 검출하는 감도가 높은 선별시험이어야 한다. 시험법 개발 초기에는 약 5~10개의 개별 시료로 컷포인트를 추정할 수 있지만, 표적 집단의 투약 경험이 없는 시료를 확보하게 되면 이를 조정하여야 할 수 있다. 최초 선별시험에서는 진양성 검출을 극대화하므로 약 5%의 낮지만 정해진 위양성률이 바람직하다. 면역원성의 실제 발생률을 정할 때에는 후속 시험법을 사용하여 위양성 결과를 배제할 수 있다.

Based on the multi-tiered approach discussed previously in section IV.A, the first assay to be employed for detection of ADA should be a highly sensitive screening assay that detects low- and high-affinity ADA. Approximately 5 to 10 individual samples may be used to estimate the cut-point early in assay development; however, this may need to be adjusted when treatment-naïve samples from the target population become available. A low but defined false-positive rate of approximately 5% is desirable for the initial screening assay because it maximizes detection of true positives. Subsequent assays can be employed to exclude false-positive results when determining the true incidence of immunogenicity.

선별시험은 약 5%의 정해진 위양성률로 혈청 시료에서 제품에 결합하는 항체의 존재를 폭넓게 검출하도록 설계되므로, FDA는 의뢰자가 치료용 단백질 제품에 특이적인 항체의 결합을 확인하는 시험법을 개발할 것을 권고한다. 적합한 확인시험을 시행하는 것은 ADA 위양성 대상자의 데이터가 ADA가 안전성 및 유효성에 미치는 영향 분석을 교란하지 않도록 하는 데 중요하다.

Because the screening assay is designed to broadly detect the presence of antibodies that bind product in serum samples with a defined false-positive rate of approximately 5%, FDA recommends that the sponsor develop assays to confirm the binding of antibodies that are specific to the therapeutic protein product. Implementation of a suitable confirmatory assay is important to prevent data on ADA false-positive subjects from confounding the analyses of the impact of ADA on safety and efficacy.

선택한 확인시험은 시험법의 위양성률이 다르다는 단서 아래 선별시험과 비슷한 감도를 가지되, 위양성 시료를 식별할 수 있도록 더 높은 특이성과 적어도 같은 수준의 선택성을 가질 것으로 기대된다. 선택한 방법과 기기 플랫폼은 선별시험에 사용한 것과 비슷하거나 다를 수 있다. 선별시험과 확인시험이 같은 방법과 기기 플랫폼을 사용하는 경우가 많다. 이러한 경우 각 시험법의 감도를 질량 단위로 측정하고, 시험법이 결합항체의 존재에 민감한지 확인하기 위해 시스템 적합성 대조물질로 확인하여야 한다. 결합 경쟁 시험을 사용할 때에는 시험법 범위 전체와 그 이상에서 항체의 존재를 확인할 수 있도록 경쟁 제품의 농도를 최적화하여야 한다.

It is expected that the selected confirmatory assay will have similar sensitivity to the screening assay, with the caveat that the assay false-positive rates are different, but have higher specificity and at least as good selectivity to identify any false-positive samples. The method and instrument platform selected may be similar to or different from those used for the screening assay. Frequently, both screening and confirmatory assays use the same method and instrument platform. In such cases, the sensitivity of each assay should be determined in mass units and confirmed using system suitability controls to ensure that the assay is sensitive to the presence of binding antibody. When using a binding competition assay, the concentration of competing product should be optimized to confirm the presence of antibodies throughout and above the range of the assay.

경쟁 억제 형식을 선택한 경우, 컷포인트를 정하는 권장 접근 방법은 경쟁물질(보통 치료용 단백질 제품) 존재하에 항체 음성인 투약 경험이 없는 대상자 시료가 내는 신호 데이터를 사용하는 것이다. 이 경우 컷포인트 설정에 사용하는 치료용 단백질 제품의 양은 시험에서 경쟁 억제제로 사용할 치료용 단백질 제품의 양과 같아야 한다. 그러나 투약 경험이 없는 집단에 기존 항체가 존재하는 시료를 다룰 때에는 이 접근 방법이 적절하지 않을 수 있다. 이러한 경우 의뢰자는 컷포인트 평가에서 진양성을 제외하여야 한다. 기저 음성 시료를 확보할 수 없는 드문 경우, 의뢰자는 선별 양성 시료를 확인하기 위해 역가 변화를 평가하거나 직교 방법(orthogonal method)을 사용할 수 있다.

If a competitive inhibition format is selected, a recommended approach to determining the cut-point uses the data from the signal generated by antibody-negative treatment-naïve subject samples in the presence of the competitor, which is usually the therapeutic protein product. In this case, the amount of therapeutic protein product used to establish the cut-point should be the same as the amount of therapeutic protein product that will be used as a competitive inhibitor in the assay. However, this approach may not be appropriate when dealing with samples where pre-existing antibodies are present in the treatment-naïve population. In those cases, the sponsor should exclude true positives from the cut-point assessment. In rare cases when baseline negative samples are not available, sponsors may evaluate changes in titer or use an orthogonal method to confirm samples that screen positive.

기존 ADA가 있는 대상자에서는 투여 후 역가 증가로 치료 증강 ADA 반응을 식별할 수 있다. 치료 증강 반응을 정의하기 위한 컷포인트를 정하여야 한다. 예를 들어, 역가를 정하는 데 2배 희석을 사용하는 경우 증강 ADA 반응은 투여 전 역가보다 희석 단계 2단계 높은 역가로 정의할 수 있다. 희석 곡선을 시험법 컷포인트까지 외삽하여 역가를 정하는 경우, 시험법 변동성 추정값을 사용하여 치료 유도 반응을 판정할 수 있다.

In subjects that have pre-existing ADA, treatment-boosted ADA responses may be identified by post-treatment increases in titer. A cut-point for defining the treatment-boosted responses should be determined. For example, a boosted ADA response may be defined as a titer that is two dilution steps greater than the pre-treatment titer, when twofold dilutions are used to determine the titer. If titer is established by extrapolating the dilution curve to the assay cut-point, treatment-induced responses may be determined using estimates of assay variability.

시험관내 중화시험은 ADA가 제품의 치료 활성을 억제할 가능성을 보여 준다. 이러한 NAb는 제품이 표적에 도달하지 못하게 하거나 수용체-리간드 상호작용 같은 약리 활성을 방해하여 치료용 단백질 제품의 임상 활성을 방해할 수 있다. ADA 양성 시료의 중화 가능성을 평가하기 위해 선택하는 시험 방법은 치료용 단백질 제품의 작용기전에 근거하여야 한다.³⁰ 감도가 매우 높은 PD 마커나 적절히 설계된 PK 시험법, 또는 둘 다가 있어 임상 활성을 알려 주는 데이터를 생성하는 일부 경우에는 이를 NAb 시험 대신 사용할 수 있다. 이 결정은 FDA와 협의하여 내려야 한다.

In vitro neutralization assays indicate the potential of ADA to inhibit the therapeutic activity of the product. Such NAb can interfere with the clinical activity of a therapeutic protein product by preventing the product from reaching its target or by interfering with its pharmacologic activity such as receptor-ligand interactions. The testing method selected to assess neutralizing potential for ADA-positive samples should be based on the mechanism of action of the therapeutic protein product.³⁰ In selected cases, where there is a highly sensitive PD marker or an appropriately designed PK assay or both that generate data that inform clinical activity, it may be possible to use these in lieu of a NAb assay. This determination should be done in consultation with the Agency.

NAb 활성 측정에는 세포 기반 생물학적 시험과 비세포 기반 경쟁 리간드 결합 시험의 두 가지 접근 방법이 사용되어 왔다. 적절한 시험 형식의 선택은 여러 요인에 따라 달라진다(Wu et al. 2016). 이러한 요인에는 치료용 단백질 제품의 작용기전과 시험법의 선택성, 감도, 정밀성, 완건성 등이 있으며, 이에 국한되지 않는다. 일반적으로 FDA는 중화시험에 세포 기반 생물학적 시험 형식을 사용할 것을 권고한다. 치료용 단백질 제품의 작용기전에 따라 중화 활성을 평가하는 다른 전략이 있을 수 있다. 예를 들어, 표적에 결합하여 이를 억제하는 길항성 mAb나 수용체 Fc 융합단백질에는 리간드 결합 시험이 적절할 수 있으나, 중화 활성을 평가하는 다른 전략은 시행하기 전에 FDA와 논의하여야 한다.

Two approaches have been used to measure NAb activity: cell-based bioassays and non-cell-based competitive ligand binding assays. Selection of the appropriate assay format depends on various factors (Wu et al. 2016). These factors include, but are not limited to, the mechanism of action of the therapeutic protein product and the selectivity, sensitivity, precision, and robustness of the assay. In general, FDA recommends that neutralization assays use a cell-based bioassay format. Depending on the therapeutic protein product’s mechanism of action, there may be alternative strategies for assessing neutralizing activity. For example, ligand binding assays may be appropriate for antagonistic mAbs or receptor Fc fusion proteins that bind and inhibit the target; however, alternative strategies to assess neutralizing activity should be discussed with the Agency before implementation.

이러한 생물학적 시험에서는 세포내 기질의 인산화, 칼슘 동원, 증식, 세포 사멸 등 다양한 세포 반응을 측정할 수 있다. 일부 경우 의뢰자는 관련 수용체나 리포터 구조체를 발현하는 세포주를 개발하기도 하였다. 치료용 단백질 제품이 세포 반응을 직접 자극하는 경우, 생물학적 시험에서 NAb가 생물활성을 감소시키는 직접 효과를 측정할 수 있다. 치료용 단백질 제품이 세포 활성에 간접적으로 영향을 주는 경우(예: 수용체-리간드 상호작용 차단), 생물학적 시험에서 NAb가 생물활성을 회복시키는 간접 효과를 측정할 수 있다. 일부 생물학적 시험은 변동성이 크고 활성 곡선의 동적 범위가 제한적이다. 이러한 문제는 중화시험의 개발과 밸리데이션을 어렵게 할 수 있다.

Different cellular responses may be measured in these bioassays, such as phosphorylation of intracellular substrates, calcium mobilization, proliferation, and cell death. In some cases, sponsors have developed cell lines to express relevant receptors or reporter constructs. When therapeutic protein products directly stimulate a cellular response, the direct effect of NAb on reducing bioactivity in the bioassay can be measured. When therapeutic protein products indirectly impact cellular activity (for example, by blocking a receptor-ligand interaction), the indirect effect of the NAb on restoring bioactivity in a bioassay can be measured. Some bioassays have significant variability and a limited dynamic range for their activity curves. Such problems can make development and validation of neutralization assays difficult.

리간드 결합 시험이나 효소 활성 시험 같은 비세포 기반 시험 형식을 사용할 수 있는 경우가 있다(Wu et al. 2016). 그 하나는 충분한 감도나 선택성을 가진 세포 기반 생물학적 시험을 개발할 수 없는 경우이다. 다른 하나는 치료용 단백질 제품의 작용기전이 세포 기반이 아닌 경우로, 예를 들어 세포 흡수가 필요 없는 효소 치료용 단백질 제품이 이에 해당한다. 이러한 경우 의뢰자는 리간드 결합 시험의 사용을 FDA와 논의하여야 한다.

There are cases when non-cell-based assay formats, such as ligand binding assays or enzyme activity assays, may be used (Wu et al. 2016). One such case is when sufficiently sensitive or selective cell-based bioassays cannot be developed. Another case is when the therapeutic protein product does not have a cell-based mechanism of action; for example, enzyme therapeutic protein products that do not require cellular uptake. Sponsors should discuss using ligand binding assays with FDA in such cases.

일반적으로 중화 생물학적 시험은 단일 농도의 치료용 단백질 제품과 단일 희석의 항체를 사용한다. 따라서 의뢰자는 활성 판독값이 억제에 민감한 치료용 단백질 제품 농도를 선택하여야 한다. 용량-반응 곡선의 아래쪽 부분에서 세포에 투여하면 중화 기준치를 충족할 만큼 반응의 동적 범위가 충분하지 않을 수 있다. 아래 그림 1에 “No”로 표시한 용량-반응 곡선의 평탄부 근처 농도에서 시험을 수행하면 NAb 양이 적은 NAb 양성 시료를 판별하지 못할 수 있다. FDA는 그림 1에 “Yes”로 표시한 곡선의 선형 범위에 있는 치료용 단백질 제품 농도에서 중화시험을 수행할 것을 권고한다.

Generally, the neutralization bioassays use a single concentration of therapeutic protein product with a single dilution of antibody. Consequently, the sponsor should choose a therapeutic protein product concentration whose activity readout is sensitive to inhibition. Dosing cells in the lower part of the dose response curve may not allow for enough dynamic range in the response to meet neutralization thresholds. If the assay is performed at concentrations near the plateaus of the dose-response curve, marked “No” in Figure 1 below, it may not be possible to discern NAb-positive samples with low amounts of NAb. FDA recommends that the neutralization assay be performed at therapeutic protein product concentrations that are on the linear range of the curve, marked “Yes” in Figure 1.

x축(농도)은 치료용 단백질 제품의 농도를, y축(활성)은 그 결과로 나타나는 활성을 나타내며, 예를 들어 치료용 단백질 제품으로 자극했을 때 세포주가 분비하는 사이토카인의 농도가 이에 해당한다. 곡선은 치료용 단백질 제품에 대해 가파르게 반응하다가 약 300에서 평탄해지는 모습을 보여 준다. “No” 화살표는 치료용 단백질 제품이 유도하는 활성이 NAb에 의한 억제에 비교적 둔감한 농도 범위에 해당하므로 단일 용량 중화시험에 사용하기에 부적절할 수 있는 치료용 단백질 제품 농도를 가리킨다. “Yes” 화살표는 치료용 단백질 제품이 유도하는 활성이 항체에 의한 중화에 민감한, 곡선의 선형 부분에 있는 농도 범위를 나타낸다.

The x-axis (Concentration) indicates a concentration of the therapeutic protein product, and the y-axis (Activity) indicates resultant activity; for example, the concentration of cytokine secretion of a cell line upon stimulation with the therapeutic protein product. The curve demonstrates a steep response to a therapeutic protein product that plateaus at approximately 300. The “No” arrows indicate a concentration of a therapeutic protein product that may be inappropriate to use in a single-dose neutralization assay because it would represent a range of concentrations where the activity induced by the therapeutic protein product would be relatively insensitive to inhibition by NAb. The “Yes” arrow represents a range of concentrations on the linear part of the curve where the activity induced by the therapeutic protein product would be sensitive to neutralization by antibody.

매트릭스는 중화시험을 간섭할 수 있으며, 특히 매트릭스 성분이 생물학적 시험에서 치료용 단백질 제품의 활성을 증강하거나 억제할 수 있다. 예를 들어, 특정 질환이 있는 대상자의 혈청에는 생물학적 시험에서 세포를 활성화할 수 있는 하나 이상의 사이토카인이 높은 수준으로 들어 있을 수 있다. 이는 원래의 자극 인자나 치료용 단백질 제품에 대한 반응을 증가시켜 NAb의 존재를 가릴 수 있다. 따라서 의뢰자는 이러한 시험에서 매트릭스 영향을 이해하고, 치료용 단백질 제품에 의해 특이적으로 활성화되는 세포주를 선택하여야 한다. 또는 특이 항체나 약물 처리에 특이적으로 반응하는 세포주를 사용하여 간섭 인자를 억제하거나 제거할 수 있다. 이러한 상황에서는 매트릭스 시료에서 ADA를 농축하는 것이 적절할 수 있다.

The matrix can interfere with neutralization assays, particularly as matrix components may enhance or inhibit the activity of a therapeutic protein product in bioassays. For example, sera from subjects with particular diseases may contain elevated levels of one or more cytokines that might serve to activate cells in the bioassay. This could obscure the presence of NAb by increasing the response to the original stimulatory factor or therapeutic protein product. Therefore, the sponsor should understand matrix effects in these assays and choose a cell line that is specifically activated by the therapeutic protein product. Alternatively, the interfering factors can be inhibited or depleted by using a specific antibody or a cell line that specifically responds to drug treatment. Enriching the ADA from matrix samples may be appropriate for these types of situations.

그러나 이 접근 방법은 NAb 손실을 일으킬 수 있으므로 의뢰자의 신중한 검토와 밸리데이션이 필요하다.

However, this approach may result in the loss of NAb and, consequently, will require careful examination and validation by the sponsor.

모든 시험법과 마찬가지로, 컷포인트는 투약 경험이 없는 대상자의 시료로 확립한 시험법 변동성에 근거하여 정하여야 한다. 선별시험과 확인시험에서 양성으로 나온 시료에 대해 중화시험을 수행하는 경우에는 보통 1%의 위양성률이 허용된다. 중화시험을 선별에 사용하는 드문 경우에는 5%의 위양성률을 사용하여야 한다(VI.B.2항 참조). 시료 변동 정도 때문에 NAb 활성을 평가하기 어려우면 다른 접근 방법을 고려할 수 있으나, 시행하기 전에 FDA와 논의하여야 한다. 또는 변동성이 더 작고 컷포인트를 더 정확하게 정할 수 있는 다른 시험 형식을 탐색할 필요가 있을 수 있다. NAb 시험에서는 약물의 작용기전에 따라 신호의 억제 또는 자극 백분율 기준치를 정하는 고정 컷포인트를 가장 흔히 설정하지만, 변동 컷포인트를 사용할 수도 있다.

As with all assays, the cut-point should be determined based on the assay variability established using samples from treatment-naïve subjects. If neutralization assays are performed on samples that tested positive in screening and confirmatory assays, a 1% false-positive rate is usually acceptable. In the rare cases when the neutralization assay is used for screening, a 5% false-positive rate should be used (see section VI.B.2). If the degree of sample variation makes it difficult to assess NAb activity, other approaches may be considered, but should be discussed with FDA before implementation. Alternatively, exploring other assay formats that lead to less variability and provide a more accurate assignment of cut-point may be necessary. Most frequently fixed cut-points are established for NAb assays where, depending on the mechanism of action of the drug, a threshold percent inhibition or stimulation of signal is established, but floating cut-points may be used.

시험법 컷포인트에 관한 일반 정보는 IV.B항을 참조한다.

See section IV.B for general information on assay cut-point.

중화시험은 대부분 항원 특이적 ADA가 있는 것으로 확인된 시료에 대해서만 수행하므로, 보통은 확인 접근 방법이 필요하지 않다. 그러나 생물학적 시험은 복잡하기 때문에, 일부 경우에는 시험법 특이성을 확인하는 것이 대상자에게 진정한 NAb 반응이 생겼는지 판단하는 데 유용할 수 있다. 의뢰자는 다음 접근 방법을 고려하여야 한다.

Because neutralization assays are most commonly performed only on samples that are confirmed to have antigen-specific ADA, confirmatory approaches are not usually necessary. However, because of the complexity of bioassays, in some cases confirmation of assay specificity may be useful in determining whether subjects have mounted a true NAb response. The sponsor should consider the following approaches:

시험법 밸리데이션은 사용하는 ADA 시험법의 성능 특성이 의도한 용도에 적합함을 특정 실험실 조사를 통해 입증하는 과정이다. 밸리데이션의 범위는 제품 개발 단계와, 치료용 단백질 제품과 관련된 면역원성이 대상자에게 미치는 결과의 위험에 따라 달라진다. 대부분의 제품에서는 1상 및 2상 시험 같은 임상 개발 초기 단계에는 시험법 감도, 특이성, 정밀성, 컷포인트, 약물 내성을 평가하고 완건성, 재현성, 안정성은 덜 강조하는 부분 밸리데이션으로 충분할 수 있다. 고위험 제품은 어떤 임상시험이든 시작하기 전에 완전 밸리데이션이 필요할 수 있다. 그러나 VI.A항에서 밝힌 바와 같이, 핵심(pivotal) 임상시험과 시판 후 연구의 시료 시험에는 완전 밸리데이션된 시험법을 사용하여야 한다.

Assay validation is a process of demonstrating, through specific laboratory investigations, that the performance characteristics of the ADA assay employed are suitable for its intended use. The extent of validation depends on the stage of product development and the risks of consequences of immunogenicity to subjects associated with the therapeutic protein product. For most products, a partial validation involving assessments of assay sensitivity, specificity, precision, cut-point, and drug tolerance — with less emphasis on robustness, reproducibility, and stability — may be adequate for the earlier stages of clinical development such as phase 1 and phase 2 studies. High-risk products may require full validation before any clinical studies. However, as stated in section VI.A, fully validated assays should be used for testing samples from pivotal and postmarketing studies.

각 시험법 유형의 밸리데이션에 관한 구체적인 정보는 VI.B항부터 VI.E항까지에 제시되어 있다. 이 항들은 IV항과 VI.A항에 제시된, 모든 시험법 유형에 관련된 정보를 보완한다.

Information specific to validation of respective assay types is provided in sections VI.B through VI.E. These sections supplement information relevant to all assay types provided in sections IV and VI.A.

핵심 임상시험에서 얻은 시료는 완전 밸리데이션된 시험법으로 시험하여야 한다. 허가 신청 시 의뢰자는 시험법이 완전 밸리데이션되었음을 입증하는 데이터를 제출하여야 한다. 밸리데이션에는 ADA 측정에 사용하는 시험법이 의도한 목적에 적합함을 입증하는 평가가 포함된다. 밸리데이션의 기본 변수에는 (1) 컷포인트, (2) 감도 및 약물 내성, (3) 특이성 및 선택성, (4) 정밀성, (5) 해당하는 경우 재현성,³¹ (6) 일부 시험법 특성의 완건성, (7) 핵심 시약의 사용 중 안정성이 포함된다.

Samples derived from pivotal studies should be tested with fully validated assays. At the time of license application, the sponsor should provide data demonstrating that the assays are fully validated. Validation includes assessments that demonstrate that an assay used for measurement of ADA is suitable for the intended purpose. The fundamental parameters for validation include (1) cut-point, (2) sensitivity and drug tolerance, (3) specificity and selectivity, (4) precision, (5) reproducibility³¹ when relevant, (6) robustness of some assay features, and (7) in-use stability of critical reagents.

컷포인트 결정은 시험법 밸리데이션의 기본 요소이다. 컷포인트 결정에는 균형 잡힌 시험 설계를 사용하여야 한다. 플레이트 내 반응의 균질성이 입증되지 않으면 컷포인트 결정 시 다른 플레이트 배치를 사용하여야 한다. 시험 전 밸리데이션에 사용할 적절한 대상자 집단의 투약 경험이 없는 시료를 구할 수 없으면 대체 시료를 사용할 수 있다.³² 이러한 시료는 상업적 공급원에서 구한 것인 경우가 많다. 밸리데이션에서 대체 시료로 컷포인트를 정한 경우, 적절한 집단의 시료(예: 시험 조건에서 채취·취급·보관한 투약 경험이 없는 대상자의 시료)를 확보하면 컷포인트를 확인하여야 한다. 투약 경험이 없는 집단의 매트릭스 시료로 확립한 컷포인트가 시험법 밸리데이션 중 얻은 컷포인트와 유의하게 다르면 컷포인트를 수정하여야 한다.

Determination of cut-point is a fundamental aspect of assay validation. Balanced study designs should be used for cut-point determination. If plate homogeneity of response is not demonstrated, alternative plate layouts should be used during cut-point determination. If treatment-naïve samples from the appropriate subject population are not available for the pre-study validation exercise, alternative samples may be used.³² Frequently, these are samples from commercial sources. When alternative samples are used to determine the cut-point in the validation exercise, the cut-point should be confirmed once samples from the appropriate population are available; for example, samples from treatment-naïve subjects that are collected, handled, and stored under study conditions. If the cut-point established using matrix samples from the treatment-naïve population is significantly different from that obtained during assay validation, the cut-point should be amended.

시험 시료의 ADA 양성 여부 판정에는 적절한 시료로 확립한 컷포인트를 사용하여야 한다.

The cut-point established using the appropriate samples should be used to determine whether study samples are positive for ADA.

기본 시험법 변수의 밸리데이션을 위해, FDA는 시험 간 정밀성을 같은 기기 플랫폼과 모델을 사용하여 서로 다른 날에 서로 다른 시험자가 평가할 것을 권고하며, 다만 모든 변동 요인을 포함하도록 서로 다른 기기를 사용하여야 한다. 이 설계에서는 시료마다 적어도 6회의 독립적인 측정이 이루어진다. 시험 내 정밀성은 같은 시험자가 독립적으로 준비한, 플레이트당 같은 시료의 독립 조제물 최소 6개로 평가하여야 한다. 또는 처리량이 적은 시험법(예: 역가시험)에서 플레이트 하나에 같은 시료의 독립 조제물 6개를 시험할 수 없는 경우, 시험 내 정밀성은 플레이트당 같은 시료의 독립 조제물 최소 3개, 총 9개 이상의 같은 시료 독립 조제물로 평가하여야 한다.

For validation of the fundamental assay parameters, FDA recommends that inter-assay precision be evaluated on different days and by different analysts using the same instrument platform and model, although different instruments should be used to include all sources of variability. This design results in at least six independent determinations for each sample. Intra-assay precision should be evaluated with a minimum of six independent preparations of the same sample per plate independently prepared by the same analyst. Alternatively, in assays with low throughput (for example, titer assays), when it may not be possible to run six independent preparations of the same sample on a plate, intra-assay precision should be evaluated with a minimum of three independent preparations of the same sample per plate and at least nine total independent preparations of the same samples.

시료에는 음성대조물질과, 시험 결과가 시험법 동적 범위의 낮은 값, 중간 값, 높은 값을 내는 양성 시료가 포함되어야 한다. 일반적으로 변동계수 백분율(%CV)로 나타낸 시험 내 및 시험 간 정밀성은 20%보다 낮을 것으로 기대된다. 그러나 세포 기반 시험 같은 일부 시험 형식에서는 더 높을 수 있다. 시험 내 또는 시험 간 정밀성의 %CV가 20%를 넘는 경우, 의뢰자는 가능한 한 시험법 정밀성을 최적화하도록 시험 변수를 개선할 필요가 있는지 검토하거나, 더 높은 %CV를 허용할 수 있는 이유를 설명하는 근거를 제시하여야 한다. 음성대조물질은 더 큰 %CV가 허용된다. 해당하는 경우 의뢰자는 기기 간 및 시험자 간 정밀성을 평가하여야 한다.

Samples should include negative controls and positive samples whose testing yields low, intermediate, and high values of the assay dynamic range. In general, the intra-assay and inter-assay precision as expressed by percent coefficient of variation (%CV) is expected to be lower than 20%. However, it may be higher in some assay formats such as cell-based assays. In cases where intra-assay or inter-assay precision has a %CV greater than 20%, sponsors should consider the need to refine the assay parameters to optimize the assay precision to the extent possible or provide justification to explain why higher %CV should be acceptable. For negative controls, a larger %CV is acceptable. The sponsor should evaluate inter-instrument and inter-operator precision when relevant.

시험법에 사용하는 방법, 기술 또는 기기 플랫폼에 따라 특정 변수를 밸리데이션하여야 할 수 있다. 예를 들어, 표면 플라스몬 공명 시험은 재생 후 표면 안정성을 밸리데이션하고 칩의 기저선 성능에 대한 기준을 정하여야 한다. 의뢰자는 개발 단계에서 완건성을 검토하고, 시험법 완건성의 어떤 측면을 밸리데이션하여야 하는지 판단하여야 한다. 예를 들어, 표지 시약의 효율과 안정성, 배양 시간과 온도를 확립하여야 한다.³³

Specific parameters may need to be validated depending on the method, technology, or instrument platform used for the assay. For example, surface plasmon resonance assays should be validated for surface stability upon regeneration, and criteria should be set for baseline performance of the chip. The sponsor should examine robustness during the development phase and determine whether aspects of assay robustness should be validated. For example, the efficiency and stability of labeled reagents and incubation times and temperature should be established.³³

이전에 밸리데이션한 방법을 변경할 때에는 의뢰자가 추가 밸리데이션이 얼마나 필요한지 판단하여야 한다. 일반적인 제품 개발 프로그램 동안 정해진 ADA 시험법이 수정될 수 있다. 때로는 최적화되어 밸리데이션된 시험법으로 시료를 재시험해야 할 수 있다. 따라서 시험법이 완전히 밸리데이션되고 FDA의 평가를 받을 때까지 재시험이 가능한 조건에서 충분한 시료량을 보존하도록 대비하여야 한다.³⁴

When changes are made to a previously validated method, the sponsor should exercise judgment as to how much additional validation is needed. During a typical product development program, a defined ADA assay may undergo modifications. Occasionally, samples may need to be re-tested with the optimized validated assay. Therefore, provisions should be made to preserve sufficient sample volume under conditions that allow for re-testing until the assays have been completely validated and evaluated by the Agency.³⁴

앞서 논의한 시험법 밸리데이션의 일반 고려사항은 모두 선별시험의 밸리데이션에 적용된다. 앞서 언급한 바와 같이, 최초 선별시험의 결과가 시료의 추가 분석 여부를 좌우하므로 이 시험에서는 감도가 특히 중요하다.

All the general considerations for assay validation discussed previously apply to validation of screening assay. As noted earlier, the sensitivity is particularly important in the initial screening assay because these results dictate the further analysis of the sample.

컷포인트는 대상자 집단에서 얻은 적절한 수(일반적으로 약 50개)의 투약 경험이 없는 시료로 통계적으로 정하여야 한다. 각 시료는 적어도 2명의 시험자가 적어도 3일에 걸쳐 시험하여 총 6회 이상 개별 측정하여야 한다. 5% 위양성률을 높은 수준으로 보증할 수 있는 한 가지 접근 방법은 음성대조 집단의 95번째 백분위수에 대해 90% 단측 하한 신뢰구간을 적용하는 것이다(Shen et al. 2015). 이렇게 하면 90% 신뢰수준으로 적어도 5%의 위양성률이 보증된다. 이 접근 방법은 시험법이 항체가 생길 수 있는 대상자를 모두 식별할 확률을 높인다. Shen 등이 발표한 접근 방법을 사용할 때에는 각 시료의 보고값을 6회 측정값의 평균으로 하여야 한다. 컷포인트를 정하는 데 사용하는 통계 방법은 데이터의 통계적 분포에 근거하여야 한다.

The cut-point should be determined statistically with an appropriate number of treatment-naïve samples, generally around 50, from the subject population. Each sample should be tested by at least two analysts on at least three different days for a total of at least six individual measurements. One approach that allows for high assurance of a 5% false-positive rate is to apply a 90% one-sided lower confidence interval for the 95th percentile of the negative control population (Shen et al. 2015). This will assure at least a 5% false-positive rate with a 90% confidence level. This approach improves the probability of the assay identifying all subjects who may develop antibodies. When using the approach published by Shen et al., the reportable value for each sample should be the average of the six measurements. The statistical method used to determine the cut-point should be based on the statistical distribution of the data.

예를 들어, 정규분포의 95번째 백분위수는 평균에 표준편차의 1.645배를 더하여 추정한다. 평균과 표준편차 대신 중앙값과 중앙값 절대편차를 사용하는 것을 포함하여, 95번째 백분위수를 추정하는 데 다른 접근 방법을 사용할 수도 있다.

For example, the 95th percentile of the normal distribution is estimated by the mean plus 1.645 standard deviation. Other approaches may be used for estimating 95th percentile, including the use of median and median absolute deviation value instead of mean and standard deviation.

음성대조 시료의 평균 반응은 일정할 수도 있고, 시험 회차, 플레이트 또는 시험자에 따라 달라질 수도 있다. 평균은 시험 회차, 플레이트 또는 시험자에 따라 달라지지만 평균 주위의 분산이 일정한 경우, 정규화 인자를 통계적으로 정하여 시험 중에 적용할 수 있다. 이를 변동 컷포인트(floating cut-point)라고 하며, 가장 흔히 사용하는 컷포인트 유형이다. 정규분포 데이터에서 평균이 일정한 경우에는 시험법 밸리데이션 중에 컷포인트를 확립하여 시험 중 시험법에 적용할 수 있다. 이를 고정 컷포인트(fixed cut-point)라고 한다. 고정 컷포인트는 시험 중 음성대조 평균이 달라질 가능성을 허용하지 않으므로 사용을 권장하지 않는다. 평균과 분산이 모두 달라지는 경우에는 시험 회차, 플레이트 또는 시험자마다 컷포인트를 확립하여야 할 수 있다.

The mean response of negative control samples may be constant or may vary between assays, plates, or analysts. When the mean varies between assays, plates, or analysts but the variance around the mean is constant, a normalization factor can be statistically determined and applied in-study. This is known as a floating cut-point and is the most common type of cut-point used. For normally distributed data, when the mean is constant, a cut-point may be established during assay validation that can be applied to the assay in-study. This is known as a fixed cut-point. The use of a fixed cut-point is discouraged because it does not allow for the possibility that negative control means may vary in-study. When both the mean and variance vary, a cut-point may need to be established for each assay, plate, or analyst.

이를 동적 컷포인트(dynamic cut-point)라고 한다. 그러나 이 접근 방법은 음성대조물질의 반복 시료가 더 많이 필요하므로 실용적이지 않은 경우가 많다. 동적 컷포인트가 필요한 것으로 나타나면, 동적 컷포인트를 사용하는 대신 시험법을 추가로 개발하는 것을 고려하여야 한다.

This is known as a dynamic cut-point. However, this approach is frequently not practical because of the need to have more replicates of the negative control. When a dynamic cut-point is indicated, further assay development should be considered instead of using a dynamic cut-point.

확인시험은 선별시험 및 중화시험과 비슷한 방식으로 완전 밸리데이션하여야 한다. 과학적으로 볼 때, 시험법 밸리데이션 시험은 선택한 시험 형식과 기기에 따라 달라진다. 이러한 시험법이 대상자 시료의 항체에 의한 항원 결합 경쟁³⁵에 근거하고 측정값이 반응의 감소인 경우, 시료를 양성으로 판정하는 데 사용할 억제 또는 제거의 정도를 정하는 것이 매우 중요하다. 과거에는 고정된 결합 감소 백분율을 사용하였으나, 이 수치는 임의적인 경우가 많았고 모든 시험법에 적용될 가능성은 낮다. FDA는 항체가 없는 것으로 알려진 음성대조 시료에 경쟁 항원을 넣었을 때 관찰되는 결합 변화의 평가에 근거하여 컷포인트를 확립할 것을 권고한다. FDA는 또한 저농도 양성대조 항체를 사용하여 확인시험의 감도를 입증할 것을 권고한다.

Confirmatory assays should be fully validated in a manner similar to screening and neutralization assays. As a scientific matter, the studies to validate the assay will depend on the assay format and instrumentation chosen. If these assays are based on competition for antigen binding³⁵ by the antibodies in subject samples and the measurement is loss of response, it is critical to identify the degree of inhibition or depletion that will be used to ascribe positivity to a sample. In the past, fixed percentages of binding reduction were used, but these numbers were often arbitrary and are unlikely to be relevant for all assays. FDA recommends establishing a cut-point based on the assessment of the binding changes observed in negative control samples that are known to lack the antibodies when competing antigen is added. FDA also recommends that the sensitivity of the confirmatory assay be demonstrated using a low concentration of the positive control antibody.

확인시험 컷포인트를 추정하는 한 가지 접근 방법은 99번째 백분위수에 대해 80%~90% 단측 하한 신뢰구간을 사용하는 것이다. 이 시험의 목적은 비특이적 결합으로 생기는 위양성 시료를 배제하는 것이므로, 확인 컷포인트 계산에는 1% 위양성률을 사용하는 것으로 충분하다. 0.1% 같은 더 엄격한 위양성률의 사용은 권장하지 않으나, 더 큰 규모의 시험에서는 허용될 수 있다. 시험법 컷포인트에 관한 일반 정보는 IV.B항을 참조한다.

One approach for the estimation of the confirmatory assay cut-point is to use an 80% to 90% one-sided lower confidence interval for the 99th percentile. Because the purpose of this assay is to eliminate false-positive samples arising as a result of non-specific binding, it is adequate to use a 1% false-positive rate for the calculation of the confirmatory cut-point. The use of tighter false-positive rates such as 0.1% is not recommended, but may be acceptable for larger studies. See section IV.B for general information on assay cut-point.

확인시험 형식은 경쟁 시험인 경우가 많으며, 이 시험에서는 경쟁물질(보통 비표지 치료용 단백질 제품³⁶)을 반응 혼합물에 넣어 ADA가 시험법의 포획 시약에 결합하는 것을 억제한다. 이 시험 형식에서는 확인 컷포인트를 정할 때 음성대조 시료에도 같은 농도의 비표지 치료용 단백질 제품을 넣어야 한다.

The confirmatory assay format is frequently a competiton assay in which a competitor, usually an unlabeled therapeutic protein product,³⁶ is added to the reaction mixture to inhibit ADA binding to the capture reagent for the assay. For this assay format, the same concentration of unlabeled therapeutic protein product should be added to the negative control samples when determining the confirmatory cut-point.

VI.A항에 기술한 시험법 밸리데이션 원칙은 일반적으로 역가시험의 밸리데이션에도 적용된다. 역가시험의 컷포인트는 선별시험의 컷포인트와 같을 수도 있고 다를 수도 있다. 예를 들어, 미국약전(USP)은 혈청의 차단 효과 때문에 시험 희석액이나 매트릭스의 신호가 선별시험 컷포인트보다 높은 결과를 내는 경우, 또는 MRD보다 높은 희석배수의 시료가 일관되게 음성 결과를 내지 않는 경우(보통 선별 컷포인트가 양성대조물질 희석 곡선의 아래쪽 평탄부에 놓일 때)에 역가시험 컷포인트를 확립할 것을 권고한다.³⁷ 역가시험 전용 컷포인트를 사용하는 경우에는 이를 밸리데이션하여야 한다. 역가시험을 선별에 사용하지 않는 경우, 컷포인트는 0.1% 위양성률로 확립할 수 있다.

The principles of assay validation described in section VI.A apply in general to validation of titration assays. The cut-point of the titration assay may be the same as or different from that of the screening assay. For example, the United States Pharmacopeia recommends establishing a titration assay cut-point when the signal from the assay diluent or matrix causes higher results than the screening assay cut-point because of a blocking effect of serum or if samples at a dilution higher than the MRD do not generate consistently negative results, usually, when the screening cut-point falls on the lower plateau of the positive control dilution curve.³⁷ When a titration assay specific cut-point is used, it should be validated. When the titration assay is not used for screening, the cut-point may be established using a 0.1% false-positive rate.

역가시험을 선별에 사용하는 경우(예: 대상자 집단에서 기존 ADA 발생률이 높은 경우)에는 컷포인트를 5% 위양성률로 확립하여야 한다.

When the titration assay is used for screening (for example, when the subject population has a high incidence of pre-existing ADA), the cut-point should be established using a 5% false-positive rate.

컷포인트를 정할 때에는 적어도 2명의 시험자가 적어도 3일에 걸쳐 시험한 최소 30개의 시료를 적절한 통계 방법으로 사용하여야 한다(V.D.4항 참조). 시험법 감도 평가는 사용하는 양성대조물질의 종류(예: mAb 또는 다클론항체), 시험법의 변동 정도, 시험법 컷포인트를 정하는 방법에 영향을 받을 수 있다. 그렇더라도 밸리데이션 중에 시험법 감도를 평가하는 것은 중요하다.

A minimum of 30 samples tested on at least 3 different days by at least two analysts should be used to determine the cut-point, using suitable statistical methods (see section V.D.4). The assessment of assay sensitivity can be affected by the kind of positive control that is used (for example, mAb or polyclonal antibody), how variable the assay is, and how the assay cut-point is determined. Nevertheless, it is important to evaluate assay sensitivity during the validation exercise.

중화시험의 양성대조물질로는 단클론항체나 친화성 정제 다클론항체를 사용할 수 있다. 또한 친화성 정제 다클론 양성대조 항체 조제물을 사용하면 항체의 일부만 중화항체일 가능성이 높아 시험법이 덜 민감해 보일 수 있다.

The positive control for neutralization assays can be either monoclonal or affinity purified polyclonal antibodies. Further, if an affinity purified polyclonal positive control antibody preparation is used, it is likely that only a portion of the antibodies are neutralizing, which can make the assay appear less sensitive.

의뢰자는 세포 기반 중화 생물학적 시험의 시험법 특이성을 밸리데이션하여야 한다. 앞서 언급한 바와 같이, 특정 치료용 단백질 제품 외의 자극에도 반응할 수 있는 세포의 경우, NAb가 다른 자극에 대한 반응이 아니라 치료용 단백질 제품에 대한 반응만 억제함을 입증할 수 있으면 시험법 특이성을 잘 보여 주는 것이다. 이러한 시험에서 FDA는 다른 자극을 치료용 단백질 제품과 비슷한 결과를 내는 농도로 사용할 것을 권고한다. 의뢰자는 또한 대상자 혈청에 다른 자극이 없음을 확인하여야 한다(IV.C항부터 E항까지 참조).

Sponsors should validate assay specificity for cell-based neutralization bioassays. As mentioned, for cells that may be responsive to stimuli other than the specific therapeutic protein product, the ability to demonstrate that NAb only inhibit the response to the therapeutic protein product and not the response to other stimuli is a good indication of assay specificity. In such studies, FDA recommends that the other stimuli be employed at a concentration that yields an outcome similar to that of the therapeutic protein product. The sponsor should also confirm the absence of alternative stimuli in subject serum (see sections IV.C through E).

생물학적 반응은 본래 정밀하게 관리된 결합 시험보다 변동이 클 수 있으므로, 세포 기반 중화 생물학적 시험은 리간드 결합 시험에 비해 정밀성이 낮은 경우가 많다. 시험법 정밀성이 낮으면 의뢰자는 정밀성 평가와 대상자 반응 평가에서 선별시험보다 더 많은 반복 시험을 수행하는 것을 고려할 수 있다(IV.F항 참조).

Cell-based neutralization bioassays frequently have reduced precision when compared to ligand binding assays because biologic responses can be inherently more variable than carefully controlled binding studies. When assay precision is poor, the sponsor may consider performing more replicates for assessment of precision and assessment of subject responses than for the screening assay (see section IV.F).

허용 계대수 범위의 낮은·중간·높은 범위에 있는 세포와 세포 밀도 및 세포 생존율을 사용할 때에는 추가 시험법 성능 변수를 확립하여야 한다. 이는 시험법 개발 중에 하는 경우가 많으며 밸리데이션에 포함되지 않을 수 있다(IV.H항 참조).

When cells at the low, middle, and high range of the allowed passage numbers and the cell density and cell viability are used, additional assay performance parameters should be established. This is frequently done during assay development and may not be part of the validation exercise (see section IV.H).

FDA는 의뢰자가 모든 대상자에게서 투여 전 시료를 확보할 것을 권고한다. 매트릭스에 기존 항체나 교란 성분이 있을 가능성이 있으므로, 투여 전 반응성의 정도를 파악하는 것이 필수적이다. 의뢰자는 투여 빈도에 따라 시점을 정하여 이후 시료를 확보하여야 한다. 최적으로는 첫 노출 후 7~14일에 채취한 시료가 초기 IgM 반응을 밝히는 데 도움이 될 수 있다. IgG 반응을 판정하는 데에는 일반적으로 첫 노출 후 3~6주에 채취한 시료가 최적이다. IgA 반응은 IgG 반응보다 이른, 항원 노출 후 약 2~3주에 정점에 이를 수 있다(Schütz et al. 2013; Macpherson et al. 2008). 치료용 단백질 제품을 1회 투여받는 사람에게는 이 시간대로 충분할 수 있다.

FDA recommends that sponsors obtain pre-treatment samples from all subjects. Because there is the potential for pre-existing antibodies or confounding components in the matrix, understanding the degree of reactivity before treatment is essential. The sponsor should obtain subsequent samples, with the timing depending on the frequency of dosing. Optimally, samples taken 7 to 14 days after the first exposure can help elucidate an early IgM response. Samples taken at 3 to 6 weeks after the first exposure are generally optimal for determining IgG responses. IgA responses may peak earlier than IgG responses, at around 2 to 3 weeks after antigen exposure (Schütz et al. 2013; Macpherson et al. 2008). For individuals receiving a single dose of a therapeutic protein product, these time frames may be adequate.

그러나 임상시험 기간 중 치료용 단백질 제품을 여러 차례 투여받는 대상자의 경우, 의뢰자는 임상시험 전반에 걸쳐 적절한 간격으로 시료를 확보하고 마지막 노출 후 약 30일에 시료를 확보하여야 한다. 반감기가 긴 제품은 마지막 노출 후 반감기의 약 5배가 지난 시점에 시료를 확보하여야 한다. ADA로 인한 중대한 결과의 위험이 높은 경우, 의뢰자는 ADA가 기저 수준으로 돌아올 때까지 대상자에게서 시료를 채취하도록 계획하여야 한다.

However, for subjects receiving a therapeutic protein product at multiple times during the trial, the sponsor should obtain samples at appropriate intervals throughout the trial and obtain a sample approximately 30 days after the last exposure. For products with long half-lives, samples should be obtained approximately five half-lives after last exposure. When there is a high risk of serious consequences from ADAs, sponsors should plan to collect samples from subjects until ADAs return to baseline levels.

매트릭스에 존재하는 치료용 단백질 제품의 간섭이 최소인 시점에 시료를 확보하는 것이 필수적이다. 의뢰자는 적절한 채취 시점을 정하는 데 도움이 되도록 치료용 단백질 제품의 반감기와 투여 요법을 고려하여야 한다. mAb 제품은 반감기가 몇 주 이상일 수 있고, 투여 요법에 따라 치료용 mAb 자체가 몇 달 동안 혈청에 남아 있을 수 있으므로 이 점이 특히 중요하다. IgE 시험이 필요한 상황에서는 시료 채취 시점을 FDA와 논의하여야 한다.

Obtaining samples at a time when there will be minimal interference from the therapeutic protein product present in the matrix is essential. A sponsor should consider the therapeutic protein product’s half-life and dosing regimen to help determine appropriate times for sampling. This is especially important for mAb products because these products can have half-lives of several weeks or more and, depending on the dosing regimen, the therapeutic mAb itself could remain present in the serum for months. Under circumstances when testing for IgE is needed, the timing of sample collection should be discussed with FDA.

임상시험의 투여 기간 중 치료용 단백질 제품이 없는 시료를 확보할 수 없는 경우, 의뢰자는 예상되는 체내 잔류 약물 존재하에서도 시험법이 민감하도록 추가 조치를 하여야 하며, 적절한 휴약 기간(일반적으로 반감기의 5배)이 지난 후 시료를 확보하여야 한다. 해당 치료용 단백질 제품 자체가 면역억제제인 경우에도 의미 있는 항체 반응을 시험하기 위한 시료 확보가 복잡해질 수 있다. 이러한 경우 가능한 한 면역억제 요법에 맞추어 시료 채취 일정을 조정하여야 한다.

If therapeutic protein product-free samples cannot be obtained during the treatment phase of the trial, the sponsor should take additional measures to ensure that the assay is sensitive in the presence of expected onboard drug; and samples should be obtained after an appropriate washout period, generally five half-lives. Obtaining samples to test for meaningful antibody response can also be complicated if the therapeutic protein product in question is itself an immune suppressant. In such instances, the sampling schedule should be adjusted in accordance with the immunosuppressant regimen, to the extent possible.

치료용 단백질 제품의 혈청 농도를 측정하기 위한 시료는 면역원성 시료와 같은 시점에 확보하여야 한다. 이러한 시료를 시험하면 시료 중 치료용 단백질 제품이 ADA 시험을 간섭하는지, ADA가 치료용 단백질 제품의 약동학을 변화시키는지에 관한 정보를 얻을 수 있다. ADA가 기저 수준에 이를 때까지 계속 시험할 수 있고 필요에 따라 시험법을 확인하거나 재적격성 평가할 수 있도록 시료를 사용할 수 있게, 시험대상자에게서 적절히 동의를 받는 것이 중요하다. 시험법 개발과 대조물질에 시료를 사용할 수 있도록 대상자의 동의를 받는 것도 유용할 수 있다.

Samples to determine serum concentrations of the therapeutic protein product should be obtained at the same time as immunogenicity samples. Testing such samples can provide information on whether the therapeutic protein product in the samples is interfering with ADA testing and whether ADA is altering the therapeutic protein product’s pharmacokinetics. It is important that study subjects be properly consented to allow for continued testing until ADAs reach baseline and samples are available to confirm or requalify assays as needed. It may also be useful to consent subjects to allow for sample use in assay development and control.

의뢰자가 적절한 밸리데이션 작업을 마치고 컷포인트를 정하면, 대상자의 면역원성 상태는 쉽게 판정할 수 있어야 한다. 그러나 양성대조 시료와 정도관리(QC) 시료는 매우 중요하며, 대상자 시료와 동시에 시험하여야 한다. 이러한 시료는 시험법에서 음성, 저농도, 고농도 신호를 내는 것으로 알려진 QC 시료로 여러 양성 수준에 걸치도록 할 것을 권고한다. 더 중요한 것은, QC 시료를 대상자 시료를 시험할 매트릭스로 희석하여야 한다는 점이다. 예를 들어, QC 시료는 대상자 시료와 같은 항응고제로 희석하여야 한다. 저농도 양성 QC 시료는 통계 분석 결과 시험 회차가 1%의 빈도로 기각되는 농도를 선택할 것을 권고한다. 이렇게 하면 의뢰자는 시험법이 예상대로 작동하고 대상자 시료가 올바르게 평가되도록 보장할 수 있다.

If the sponsor completes the proper validation work and makes the cut-point determinations, the immunogenicity status of subjects should be straightforward to determine. However, positive control and quality control (QC) samples are critical and should be run concurrently with subject samples. We recommend that these samples span a level of positivity with QC samples having a known negative, low, and high signal in the assay. More important, the QC samples should be diluted in the matrix in which subject samples will be examined. For example, the QC sample should be diluted in the same anticoagulant as the subject samples. For the low-positive QC sample, we recommend that a concentration be selected that, upon statistical analysis, would lead to the rejection of an assay run 1% of the time. In this way, the sponsor ensures that the assay is performing as expected and that subject samples are correctly evaluated.

시험법에 프로존 효과가 나타날 수 있으면 고농도 양성 QC 시료의 농도를 프로존 효과를 감시할 수 있도록 정하여야 한다.³⁸

If the assay is subject to a prozone effect, the concentration of high-positive QC samples should be set to monitor prozone effects.³⁸

FDA는 또한 관찰될 수 있는 음성 결과가 2차 시약의 실패 때문이 아니라 실제로 항원 반응성이 없기 때문임을 보장하기 위하여, 이러한 QC 시료를 2차 검출 시약으로 검출되는 항체를 가진 사람이나 동물에서 얻을 것을 권고한다. 표지 항원을 검출에 사용하는 브리지 시험에서는 이 문제가 생기지 않는다.

FDA also recommends that these QC samples be obtained from humans or animals possessing antibodies that are detected by the secondary detecting reagent to ensure that negative results that might be observed are truly caused by lack of antigen reactivity but not caused by failure of the secondary reagent. This issue is not a problem for bridging assays where labeled antigen is used for detection.

집단이 다르면 ADA 시험에서 시료의 배경 활성이 다를 수 있다. 마찬가지로, 시험법 밸리데이션 중 컷포인트를 정하는 데 사용한 시료를 시험 중 시료의 채취·취급 방식을 대표하는 방식으로 채취·취급하지 않은 경우에도 배경 활성이 달라질 수 있다. 따라서 시험법 밸리데이션 중 정한 컷포인트가 연구 대상 집단에 적합한지 확인할 필요가 있다. 표적 집단에서 충분한 수의 시료를 사용하여야 하며, 사용한 시료 수의 근거를 제시하여야 한다. 충분한 수의 시료를 확보할 수 없으면 사용할 시료 수에 대해 FDA와 합의하여야 한다.

Samples from different populations can have different background activity in ADA assays. Similarly, the background activity can change when samples used to determine the cut-point during assay validation were not obtained and handled in a manner that represents how samples will be obtained and handled in-study. Therefore, it is necessary to confirm that the cut-point determined during assay validation is suitable for the population being studied. A sufficient number of samples from the target population should be used, and justification for the number used should be provided. If sufficient numbers of samples are not available, agreement with the Agency should be sought for the number of samples to be used.

현재 면역원성 평가와 관련된 데이터는 eCTD의 여러 위치에 흩어져 있다. 치료용 생물의약품의 임상 개발을 쉽게 하기 위하여, 의뢰자가 치료용 단백질 제품 개발 초기부터 작성하기 시작하여 개별 제품의 임상 프로그램이 IND 단계에서 BLA, 나아가 허가 후 단계로 진행함에 따라 정기적으로 갱신하는 통합 면역원성 요약 보고서를 만들어, 면역원성에 수명주기 관리 접근 방법을 적용할 것을 권고한다. 이 문서는 단계에 맞는 정보가 확보되는 대로 채워 넣을 수 있도록 (1) 면역원성 위험성 평가, (2) 단계적 생체시료분석 전략 및 시험법 밸리데이션 요약, (3) 임상시험 설계 및 상세 면역원성 시료 채취 계획, (4) 임상 면역원성 데이터 분석, (5) 결론 및 위험 평가·완화 전략(REMS) 등 별도의 항으로 구성할 것을 권고한다.

Currently the data relevant to the assessment of immunogenicity are dispersed throughout different locations of the eCTD. To facilitate the clinical development of therapeutic biologics, we recommend a life-cycle management approach to immunogenicity through the creation of an integrated immunogenicity summary report that sponsors begin populating early in therapeutic protein product development and update at regular intervals as the individual product clinical program progresses through IND stages into the BLA and even postapproval stages. We recommend that the document be arranged into distinct sections to be populated with stage-appropriate information as it becomes available, including (1) Immunogenicity Risk Assessment, (2) Tiered Bioanalytical Strategy and Assay Validation Summaries, (3) Clinical Study Design and Detailed Immunogenicity Sampling Plans, (4) Clinical Immunogenicity Data Analysis, and (5) Conclusions and Risk Evaluation and Mitigation Strategies (REMS).

BLA 자료의 경우, 신청자는 면역원성 결과의 간략한 요약을 eCTD 2.7항 임상 요약(Clinical Summary)의 관련 부분에, 전체 보고서를 5.3.5.3항 둘 이상의 시험 데이터 분석 보고서(Reports of Analysis of Data from More than One Study)에 제출할 것을 권고한다.³⁹ 이 통합 면역원성 요약에는 다음 내용이 들어 있어야 한다.

For the BLA file, we recommend that the applicant provide brief summaries of the immunogenicity results in relevant places in eCTD section 2.7. Clinical Summary and the full report in section 5.3.5.3 Reports of Analysis of Data from More than One Study.³⁹ This Integrated Summary of Immunogenicity should provide the following: