이 가이던스는 이 주제에 관한 FDA의 현재 견해를 나타낸다. 이 가이던스는 누구에게도 어떠한 권리를 설정하지 않으며, FDA나 일반 대중을 구속하지 않는다. 적용 법률과 규정의 요건을 충족한다면 다른 접근 방법을 사용할 수 있다. 다른 접근 방법을 논의하려면 표지에 적힌, 이 가이던스를 담당하는 FDA 직원에게 연락한다.

This guidance represents the current thinking of the Food and Drug Administration (FDA or Agency) on this topic. It does not establish any rights for any person and is not binding on FDA or the public. You can use an alternative approach if it satisfies the requirements of the applicable statutes and regulations. To discuss an alternative approach, contact the FDA staff responsible for this guidance as listed on the title page.

복제 가능 레트로바이러스(RCR)의 잠재적 병원성 때문에 레트로바이러스 벡터 기반 사람 유전자치료제¹에 RCR이 존재하지 않음을 배제하기 위한 철저한 시험이 필요하다(Ref. 1). FDA는 레트로바이러스 벡터 기반 사람 유전자치료제의 의뢰자에게, 레트로바이러스 벡터 기반 유전자치료제의 제조 중 및 레트로바이러스 벡터 기반 유전자치료제를 투여받은 환자의 추적 관찰 중 RCR 시험에 관한 권고사항을 제공한다.² 권고사항에는 시험할 물질의 확인과 양은 물론 일반적인 시험방법도 포함된다. 또한 레트로바이러스 벡터 기반 유전자치료제 투여 후 레트로바이러스 감염의 증거를 환자에서 관찰하기 위한 권고사항도 제공한다.

The potential pathogenicity of replication competent retrovirus (RCR) requires vigilant testing to exclude the presence of RCR in retroviral vector-based human gene therapy products¹ (Ref. 1). We, FDA, are providing you, sponsors of retroviral vector-based human gene therapy products, recommendations regarding the testing for RCR during the manufacture of retroviral vector-based gene therapy products, and during follow-up monitoring of patients who have received retroviral vector-based gene therapy products.² Recommendations include the identification and amount of material to be tested as well as general testing methods. In addition, recommendations are provided for monitoring patients for evidence of retroviral infection after administration of retroviral vector-based gene therapy products.

레트로바이러스과(Retroviridae)는 두 개의 아과로 구성된다. 즉 알파레트로바이러스(Alpharetrovirus), 베타레트로바이러스(Betaretrovirus), 감마레트로바이러스(Gammaretrovirus), 델타레트로바이러스(Deltaretrovirus), 엡실론레트로바이러스(Epsilonretrovirus), 렌티바이러스(Lentivirus)의 6개 속으로 이루어진 오르토레트로바이러스아과(Orthoretrovirinae)와, 최근 보비스푸마바이러스(Bovispumavirus), 에퀴스푸마바이러스(Equispumavirus), 펠리스푸마바이러스(Felispumavirus), 프로시미이스푸마바이러스(Prosimiispumavirus), 시미이스푸마바이러스(Simiispumavirus)의 5개 속으로 이루어지도록 갱신된 스푸마레트로바이러스아과(Spumaretrovirinae, 포미바이러스)이다(Refs. 2, 3).

The Retroviridae family is composed of two subfamilies: Orthoretrovirinae, which consists of six genera of viruses: Alpharetrovirus, Betaretrovirus, Gammaretrovirus, Deltaretrovirus, Epsilonretrovirus, and Lentivirus, and Spumaretrovirinae (foamy viruses) which has recently been updated to consist of five genera of viruses: Bovispumavirus, Equispumavirus, Felispumavirus, Prosimiispumavirus, and Simiispumavirus (Refs. 2, 3).

RCR은 이들 속 중 어느 것으로부터 유래한 레트로바이러스 벡터의 제조 중에도 생성될 수 있다. 현재 가장 일반적인 레트로바이러스 기반 벡터는 감마레트로바이러스 또는 렌티바이러스로부터 구축되므로, 이들 속에 대하여 더 자세한 내용을 제공한다. 역사적으로 렌티바이러스 RCR은 복제 가능 렌티바이러스(RCL)로 불려 왔다.³

RCR may potentially be generated during the manufacture of a retrovirus vector from any of these genera. At this time, the most common retrovirus-based vectors are constructed from gammaretroviruses or lentiviruses, and therefore further details are provided for these genera. Historically, lentivirus RCR is referred to as replication competent lentivirus (RCL).³

이 가이던스는 2006년 11월자 “Guidance for Industry: Supplemental Guidance on Testing for Replication Competent Retrovirus in Retroviral Vector Based Gene Therapy Products and During Follow-up of Patients in Clinical Trials Using Retroviral Vectors”(2006 RCR 가이던스)를 대체한다(Ref. 4).

This guidance supersedes the guidance entitled, “Guidance for Industry: Supplemental Guidance on Testing for Replication Competent Retrovirus in Retroviral Vector Based Gene Therapy Products and During Follow-up of Patients in Clinical Trials Using Retroviral Vectors” dated November 2006 (2006 RCR Guidance) (Ref. 4).

이 가이던스는 또한 다음 두 개의 최종 가이던스를 보충한다. 즉 2020년 1월자 “Long Term Follow-Up After Administration of Human Gene Therapy Products; Guidance for Industry”(장기 추적조사 가이던스)와 2020년 1월자 “Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug Applications (INDs); Guidance for Industry”(CMC 가이던스)이다.⁴ 이 가이던스는 2018년 7월자 동일 제목의 초안 가이던스를 최종화한 것이다.

This guidance also supplements the following two final guidances: the “Long Term Follow-Up After Administration of Human Gene Therapy Products; Guidance for Industry” dated January 2020 (Long Term Follow-up Guidance) and “Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug Applications (INDs); Guidance for Industry” dated January 2020 (CMC Guidance).⁴ This guidance finalizes the draft guidance of the same title dated July 2018.

이 가이던스를 포함한 FDA의 가이던스 문서는 법적으로 집행 가능한 책임을 설정하지 않는다. 가이던스는 특정 규정 또는 법률 요건이 인용되지 않은 경우, 해당 주제에 관한 FDA의 현재 견해를 설명하는 것이며 권고사항으로만 보아야 한다. FDA의 가이던스에서 should라는 단어의 사용은 어떤 것이 제안되거나 권고되지만 요구되지는 않음을 뜻한다.

FDA’s guidance documents, including this guidance, do not establish legally enforceable responsibilities. Instead, guidances describe the FDA’s current thinking on a topic and should be viewed only as recommendations, unless specific regulatory or statutory requirements are cited. The use of the word should in FDA’s guidances means that something is suggested or recommended, but not required.

레트로바이러스 벡터 생산 중 및 환자 관찰 중 RCR 시험에 관한 FDA 생물의약품평가연구센터(CBER)의 권고사항은 임상 경험이 감마레트로바이러스 벡터를 사용한 소수의 연구에 국한되어 있던 시기에 처음 마련되었다(Ref. 5). 당시 레트로바이러스 벡터 사용과 관련된 가장 중요한 안전성 우려는, 고역가 RCR에 의도치 않게 노출된 감마레트로바이러스 벡터 형질도입 골수 전구세포를 중증 면역억제 상태의 붉은털원숭이에 투여한 동물시험 결과로 잘 드러났다(Ref. 1). 이 시험에서 10마리 중 3마리가 림프종이 발생하여 200일 이내에 죽었다. 림프종에서 다수의 뮤린 RCR 염기서열이 확인되고 항레트로바이러스 항체와 질병 발생 사이에 역상관관계가 있었다는 점에서, RCR이 이 질병의 원인과 관련된 것으로 추정되었다(Refs. 6, 7).

FDA’s Center for Biologics Evaluation and Research (CBER) recommendations for RCR testing during retroviral vector production and patient monitoring were originally developed at a time when clinical experience was limited to a small number of studies using gammaretrovirus vectors (Ref. 5). At that time, the overriding safety concerns associated with the use of retroviral vectors were exemplified by the findings of an animal study involving administration of gammaretroviral vector-transduced bone marrow progenitor cells that had been inadvertently exposed to high-titer RCR, and administered to severely immunosuppressed rhesus monkeys (Ref. 1). In this setting, 3/10 animals developed lymphomas and died within 200 days. The RCR was presumed to be etiologically associated with the disease by virtue of the presence of multiple murine RCR sequences in the lymphomas and an inverse correlation between anti-retroviral antibodies and development of disease (Refs. 6, 7).

반면 중등도 면역억제 상태의 사이노몰거스원숭이에 RCR을 정맥 내로 노출시킨 다른 시험에서는 질병의 징후가 나타나지 않았다(Refs. 8, 9).

In contrast, another study in moderately-immunosuppressed cynomolgus monkeys exposed intravenously to RCR showed no signs of disease (Refs. 8, 9).

20년이 넘는 경험을 통하여, 서로 다른 벡터 설계, 벡터 생산 세포, RCR 검출 시험법에 관한 경험과, 벡터 로트·생체외 형질도입 세포·관찰 중 채취한 환자 검체의 RCR 시험에서 양성 결과가 없었다는 사실을 비롯하여 유전자치료 임상 적용에서 레트로바이러스 벡터의 안전성에 관한 상당한 양의 자료가 축적되었다. 이러한 자료는 1996년 및 1997년 FDA/미국 국립보건원(NIH) 유전자치료 학술회의의 레트로바이러스 분과회의, 2010년 세포·조직·유전자치료제 자문위원회 회의(Ref. 10), 2014년 미국유전자세포치료학회(ASGCT) 복제 가능 바이러스 분과회의(Ref. 11)를 비롯한 공개 논의의 기초가 되었다. 또한 FDA 과학자들은 레트로바이러스 벡터 사용과 관련된 RCR 시험방법에 대한 평가를 발표하였다(Ref. 12).

More than two decades of experience has generated a substantial amount of data on the safety of retroviral vectors in clinical applications for gene therapy, including experience with different vector designs, vector producing cells, RCR detection assays, and lack of positive results from RCR testing of vector lots, ex vivo transduced cells, and patient samples collected during monitoring. These data have provided the basis for public discussions, including Retroviral Breakout Sessions at the 1996 and 1997 FDA/National Institutes of Health (NIH) Gene Therapy Conferences, the 2010 Cellular, Tissue, and Gene Therapies Advisory Committee meeting (Ref. 10), and the 2014 American Society of Gene and Cellular Therapy (ASGCT) Breakout Session on Replication Competent Virus (Ref. 11). In addition, FDA scientists published an evaluation of RCR testing methods associated with the use of retroviral vectors (Ref. 12).

이 기간에 유전자치료 분야는 제조공정 중 RCR이 생성될 가능성을 낮추기 위하여 레트로바이러스 벡터 설계를 개선하였다(Refs. 13, 14). 예를 들어 벡터 유전체를 외피 유전자 및 패키징 기능과 별개의 플라스미드에 두는 분할 플라스미드 설계로 벡터를 제조하면 재조합에 의하여 RCR이 생성될 가능성이 낮아진다. 벡터 생산에 두 개를 초과하는 플라스미드를 사용하면 RCR 생성을 더욱 줄일 수 있다. 렌티바이러스 벡터는 바이러스 보조 단백질 및 조절 단백질을 암호화하는 유전자를 제거하도록 추가로 변형되었으며, 이는 RCR이 생성되는 경우 그 RCR의 기능을 약화시킬 것이다(Refs. 15, 16).

During this time, the gene therapy community has improved retroviral vector design to reduce the likelihood of generating RCR during the manufacturing process (Refs. 13, 14). For instance, the likelihood that recombination will generate RCR is reduced by manufacturing vectors using a split plasmid design, where the vector genome is on a separate plasmid from the envelope gene and packaging functions. RCR generation can be further reduced by using more than two plasmids for vector production. Lentiviral vectors have been further modified to remove genes encoding viral accessory and regulatory proteins, which would cripple the functionality of an RCR in the event an RCR may be generated (Refs. 15, 16).

2006 RCR 가이던스로부터의 개정 내용 요약:

Summary of Revisions from the 2006 RCR Guidance:

레트로바이러스 벡터 설계 및 시험과 관련하여 축적된 안전성에 관한 과학적 근거를 고려하여, 레트로바이러스 벡터 기반 유전자치료제의 제조 중 및 환자 관찰 중 RCR 시험에 관한 현행 권고사항을 개정한다. 보다 구체적으로, 레트로바이러스 생산 세포의 제조용세포은행에 대한 RCR 시험은 더 이상 권고하지 않는다. 또한 시험하여야 하는 벡터의 양에 관한 권고사항도 개정하였다(이 문서의 III.B항 및 부록 1-1). 요약하면, 임상 제조 관행에 적용 가능한 경우 벡터가 환자 투여용량당 RCR 1개 미만을 함유함을 입증할 수 있는 충분한 양의 벡터를 시험할 것을 권고한다. 아울러 배양 기간이 4일 이하인 것을 포함하여 모든 레트로바이러스 벡터 형질도입 세포 제품에 대하여 RCR 시험을 할 것을 권고한다.

With consideration of the accrued scientific evidence of safety associated with retroviral vector design and testing, we are revising our current recommendations for RCR testing during retroviral vector-based gene therapy product manufacture and patient monitoring. More specifically, we are no longer recommending RCR testing on working cell banks for retroviral producer cells. We have also revised our recommendations regarding the amount of vector that should be tested (section III.B and Appendix 1-1 of this document). Briefly, we are recommending that you test a sufficient amount of vector to demonstrate that your vector contains <1 RCR per patient dose, when applicable to your clinical manufacturing practice. Additionally, we are recommending that all retroviral vector transduced cell products be tested for RCR, including those cultured for 4 days or less.

배양 기간의 길이가 형질도입 세포에서 RCR 발생 가능성에 영향을 미친다는 설득력 있는 근거는 확인되지 않았다. 다만 형질도입 세포 제품이 일관되게 RCR 음성임을 입증하는 제조 및 임상 경험이 축적되어 있다면(이 문서의 III.A.4항), 생체외 유전적 변형 세포에 대한 RCR 시험의 축소 또는 생략을 뒷받침하기 위하여 그 자료를 제출할 것을 권고한다. 또한 시험용 분석법에 관한 권고사항도 개정하였다(이 문서의 III.C항). 구체적으로, 특히 시간 제약이 있는 경우에는 배양 기반 방법을 대신하여 대체 방법이 생체외 형질도입 세포의 로트 출하 시험에 적절할 수 있다.

We have found no convincing evidence that the length of culture time influences the likelihood of RCR development in transduced cells. However, if you have accumulated manufacturing and clinical experience that demonstrates that your transduced cell product is consistently RCR-negative (section III.A.4 of this document), we recommend that you provide this data to support reduction or elimination of testing ex vivo genetically modified cells for RCR. We have also revised our recommendations regarding assays for testing (section III.C of this document). Specifically, alternative methods may be appropriate for lot release testing of ex vivo transduced cells in lieu of culture based methods, particularly when there are time constraints present.

마지막으로, 레트로바이러스 벡터 기반 제품 투여 후 환자의 능동적 관찰에 관한 권고도 개정하였고(이 문서의 IV항), RCR 시험 및 위해성 평가에 관한 허가 후 고려사항을 추가하였다(이 문서의 VI항). 레트로바이러스 벡터 기반 유전자치료제의 제조 중 및 환자 관찰 중 RCR 분석법 개발과 시험 일정에 관한 고려사항은 일반적으로 제품별로 다르므로, FDA는 가능하면 이른 시기, 즉 사전 IND 회의 때부터 제품 개발 전 과정에 걸쳐 CBER의 조직·첨단치료제실(OTAT)과 소통할 것을 권고한다.

Finally, we have revised our advice for active monitoring of patients following administration of retroviral vector-based products (section IV of this document), and added post-licensure considerations for RCR testing and risk assessment (section VI of this document). Because considerations for RCR assay development and testing schedule during retroviral vector-based gene therapy product manufacture and patient monitoring are generally product-specific, FDA recommends communication with the Office of Tissues and Advanced Therapies (OTAT) at CBER, preferably early, i.e., during your pre-IND meeting, as well as throughout your product development.

일반적으로 레트로바이러스 벡터는 배양 세포에서 일시적 또는 안정적 생산을 거친 후 상층액을 수집하여 제조한다. RCR은 최초 형질주입 또는 형질도입 단계부터 레트로바이러스 벡터 상층액의 생산에 이르기까지 제조 중 어느 단계에서도 발생할 수 있다. 또한 레트로바이러스 벡터를 세포의 생체외 유전적 변형에 사용하는 경우, 생체외 형질도입 세포를 배양에서 증식시키는 과정은 레트로바이러스 벡터 상층액에서 검출한계 미만일 수 있는 RCR 오염물질이 증폭될 가능성을 제공한다. 따라서 현행 권고사항에는 제품 제조의 여러 단계에서 나온 물질에 대한 시험이 포함된다(이 문서의 표 참조).

Generally, retroviral vectors are manufactured by collection of supernatant following transient or stable production from cultured cells. RCR may develop at any step during manufacturing, from the initial transfection or transduction steps through production of the retroviral vector supernatant. In addition, if the retroviral vector is used for ex vivo genetic modification of cells, the expansion of ex vivo transduced cells in culture provides the potential for amplification of an RCR contaminant that may be below the level of detection in the retroviral vector supernatant. Therefore, current recommendations include testing of material from multiple stages of product manufacture (see Table of this document).

벡터를 일시적 형질주입으로 생산하는 경우, 모든 세포은행은 CMC 가이던스의 V.A.2.c.iii.a항에 따라 적격성 평가를 하여야 한다. 레트로바이러스 벡터의 RCR 특이 시험 요건은 벡터 상층액(이 문서의 III.A.3항), 생산 종료 세포(이 문서의 III.A.3항) 및 해당되는 경우 생체외 형질도입 세포(이 문서의 III.A.4항)에 대하여 아래에 기술한다.

When the vector is produced by transient transfection, all cell banks should be qualified according to section V.A.2.c.iii.a of the CMC Guidance. Retroviral vector RCR-specific testing requirements are outlined below for the vector supernatant (section III.A.3 of this document), end of production cells (section III.A.3 of this document), and ex vivo transduced cells (section III.A.4 of this document), if applicable.

레트로바이러스 벡터를 충분하고 일관되게 공급받기 위하여 가능하면 안정적으로 형질주입된 벡터 생산 세포(VPC) 은행 시스템을 사용할 것을 권고한다. VPC의 마스터세포은행(MCB)을 수립하면 단일 세포 클론에서 유래한 균일한 조성의 세포를 수집할 수 있다. 제조용세포은행(WCB)은 MCB로부터 연속 계대배양으로 특정 계대수까지 증식시켜 유래한다(1993년 5월자 “Points to Consider in the Characterization of Cell Lines Used to Produce Biologicals” 참조).⁵

We recommend use of a stably-transfected Vector Producer Cell (VPC) bank system, when possible, in order to ensure an adequate and consistent supply of retroviral vector. The generation of a Master Cell Bank (MCB) for the VPC allows for the collection of cells of uniform composition derived from a single cell clone. The Working Cell Bank (WCB) is derived from the MCB, following expansion by serial subculture to a specified passage number (refer to “Points to Consider in the Characterization of Cell Lines Used to Produce Biologicals” dated May 1993)⁵.

벡터를 VPC 은행을 사용하여 생산하는 경우에는 벡터 상층액(이 문서의 III.A.3항), 생산 종료 세포(이 문서의 III.A.3항) 및 해당되는 경우 생체외 형질도입 세포(이 문서의 III.A.4항)에 더하여 VPC MCB(이 문서의 III.A.1항)에 대한 RCR 특이 시험이 권고된다.

When the vector is produced using VPC banks, RCR-specific testing of the VPC MCB (section III.A.1 of this document) is recommended in addition to vector supernatant (section III.A.3 of this document), end of production cells (section III.A.3 of this document), and ex vivo transduced cells (section III.A.4 of this document), if applicable.

VPC MCB의 세포와 상층액 모두를, 벡터를 만드는 데 사용한 모(母)바이러스의 숙주 선택성에 따라 선정한 세포주를 사용하여 RCR에 대하여 시험하여야 한다. 예를 들어 긴팔원숭이 백혈병 바이러스(GALV) 외피 또는 수포성 구내염 바이러스 당단백질(VSV-G) 같은 외피를 함유한 VPC는 통상 사람 세포주에서 시험한다. 그 밖의 레트로바이러스 외피는 해당 RCR의 감염을 허용하는 세포주에서 시험하여야 한다.

Both cells and supernatant from the VPC MCB should be tested for RCR using a cell line selected based on the tropism of the parental virus used to generate the vector. For example, VPC containing envelopes such as gibbon ape leukemia virus (GALV) envelope or vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) are typically tested on a human cell line. Other retroviral envelopes should be tested on a cell line permissive for infection by the relevant RCR.

VPC MCB를 임상용 벡터 제품과 다른 외피로 위형화(pseudotyped)한 레트로바이러스 벡터로 생산한 경우, 예를 들어 생태형(ecotropic) 뮤린 백혈병 바이러스(MLV)인 경우에는 그 다른 외피를 가진 RCR이 유입될 가능성이 있다. 생태형 MLV RCR이 사람에게 직접적인 안전성 위해를 거의 주지 않더라도, VPC 내 요소와의 재조합을 통하여 사람을 숙주 범위로 하는 RCR이 생성될 확률이 높아지기 때문에 VPC MCB에 복제 가능한 유전체가 존재하는 것은 문제가 된다.

If the VPC MCB was produced using a retroviral vector pseudotyped with an envelope distinct from the clinical vector product, for example, an ecotropic Murine Leukemia Virus (MLV), the potential exists for introduction of an RCR with that distinct envelope. Even though an ecotropic MLV RCR may present a minimal direct safety risk to humans, the presence of any replication-competent genome in the VPC MCB is problematic because of the increased probability of generating an RCR with a human host range through recombination with elements within the VPC.

따라서 VPC가 어느 단계에서든 생태형 레트로바이러스 벡터에 의한 형질도입으로 유래한 경우에는, 양쪽성(amphotropic) RCR 시험에 더하여 생태형 RCR 존재에 대한 MCB 시험이 권고된다. 예를 들어 생태형 MLV 외피를 함유할 가능성이 있는 VPC는 생태형 MLV 유사 RCR의 감염을 허용하는 적절한 세포주에서 RCR에 대하여 시험하여야 한다(Ref. 17).

Therefore, in cases where VPC are derived, at any step, by transduction with an ecotropic retroviral vector, testing of the MCB for the presence of ecotropic RCR is recommended, in addition to amphotropic RCR testing. For example, VPC possibly containing ecotropic MLV envelope should be tested for RCR on an appropriate cell line which is permissive to infection by ecotropic MLV-like RCR (Ref. 17).

적절히 적격성 평가를 한 VPC MCB에서 유래한 VPC WCB로 벡터를 생산하는 동안 RCR이 생성될 위험은 축적된 경험에 비추어 비교적 낮다. 따라서 이 가이던스에 기술된 권고사항에 비추어 VPC MCB의 RCR 시험이 충분하지 않은 경우를 제외하고는 VPC WCB의 RCR 시험을 권고하지 않는다.

The risk of generating RCR during vector production with a VPC WCB that is derived from an appropriately qualified VPC MCB is relatively low based on our accumulated experience. Therefore, we do not recommend RCR testing of the VPC WCB except when RCR testing of the VPC MCB is insufficient based on recommendations described herein.

레트로바이러스 벡터 상층액 로트와 생산 종료(EOP) 세포 모두를 RCR에 대하여 시험하여야 한다. EOP 세포는 레트로바이러스 함유 상층액의 단일 벌크 수확이 이루어진 세포 또는 연속적인 상층액 수확 중 마지막 수확이 이루어진 세포로 정의된다. 이 권고사항은 1997년 FDA/NIH 유전자치료 학술회의에서 보고된 자료와 경험에 근거하며, 그 회의에서는 벡터 생산 로트의 RCR이 벡터 상층액과 EOP 세포 양쪽에서 항상 일관되게 검출되지는 않았다고 보고되었다. 이러한 자료는 이중 시험이 RCR이 없는 레트로바이러스 벡터를 보증하는 상호 보완적 접근 방법이 된다는 입장을 뒷받침한다.

Both retroviral vector supernatant lots and end of production (EOP) cells should be tested for RCR. EOP cells are defined as cells from which a single bulk harvest of retrovirus-containing supernatant is taken or cells from which the last of a serial set of supernatant harvests is taken. This recommendation is based on data and experience reported at the 1997 FDA/NIH Gene Therapy Conference, where it was reported that RCR in vector production lots was not always consistently detected in both vector supernatant and EOP cells. These data support the position that dual testing provides a complementary approach to assuring RCR-free retroviral vector.

레트로바이러스 벡터를 세포의 생체외 유전적 변형에 사용하는 경우, 벡터에 검출되지 않는 수준의 RCR이 존재할 수 있으며 이것이 생체외 형질도입 세포의 제조 중 증폭될 수 있다. 따라서 생체외 레트로바이러스 형질도입 세포의 각 로트를 RCR에 대하여 시험할 것을 권고한다. 배양 기간의 길이(예: 4일 초과)가 RCR 발생 가능성에 강하게 영향을 미친다는 것이 입증되지 않았으므로, 이 권고사항은 형질도입 후 세포를 배양한 기간의 길이와 관계없이 적용된다.

If the retroviral vector is used for ex vivo genetic modification of cells, it is possible that RCR may be present in your vector at undetectable levels, which could be amplified during the manufacture of ex vivo transduced cells. Therefore, we recommend that each lot of ex vivo retroviral transduced cells be tested for RCR. This recommendation applies regardless of the length of time that the cells are cultured after transduction, because the length of culture time (e.g., greater than 4 days) has not been shown to strongly influence the likelihood of RCR development.

다만 재조합 가능성을 최소화하도록 의도적으로 설계된 벡터에 대한 경험은 많은 벡터에서 형질도입 세포 내 RCR의 증폭이 일어나기 어렵다는 것을 시사한다. 형질도입 세포 제품이 일관되게 RCR 음성임을 입증하는 제조 및 임상 경험이 축적되어 있다면, 생체외 유전적 변형 세포에 대한 RCR 시험의 축소 또는 생략을 뒷받침하기 위하여 그 자료를 제출할 것을 권고한다. RCR 생성 가능성을 낮추는 벡터 설계상의 안전성 요소에 대한 논의, 현행 가이던스에 따른 벡터 시험에 대한 기술, 그리고 RCR이 없는 세포 제품의 제조 경험을 포함할 것을 권고한다.

However, experience with vectors that have been deliberately designed to minimize the likelihood of recombination suggests that amplification of RCR in transduced cells is unlikely for many vectors. If you have accumulated manufacturing and clinical experience that demonstrates that your transduced cell product is consistently RCR-negative, we recommend that you provide this data to support reduction or elimination of testing ex vivo genetically modified cells for RCR. We recommend you include a discussion of safety features in the vector design that reduces the likelihood of generating RCR, a description of vector testing in accordance with current guidance, and your experience manufacturing RCR-free cell products.

생체외 형질도입 세포의 로트 출하를 위한 RCR 시험의 생략을 뒷받침하는 정보는 IND에(즉, 전자 국제공통기술문서(eCTD)의 제조공정 개발 3.2.S.2.6항 또는 3.2.P.2.3항에) 제출할 수 있으며, 또는 사전 IND 회의에서 FDA와 논의할 수 있다.

You may provide information supporting removal of RCR testing for lot release of ex vivo transduced cells in your IND (i.e., in the section titled: Manufacturing Process Development Section 3.2.S.2.6 or 3.2.P.2.3 of the electronic Common Technical Document (eCTD)) or discuss with the FDA during your pre-IND meeting.

누적된 정보가 생체외 레트로바이러스 형질도입 세포 제품의 출하 시험에서 RCR 시험의 중단을 충분히 뒷받침하는 경우에는, 제품 유효기한 이후 최소 6개월 동안 검체를 보관할 것을 권고한다. 향후 필요한 경우 RCR 시험을 수행할 수 있도록 충분한 양(이 문서의 III.B.2항 및 부록)의 세포 제품을 보유할 것을 권고한다(이 문서의 IV항). 검체는 장기 보관을 보증하는 적절한 안전장치(예: 감시되는 냉동고 경보 보관 시스템)와, 보관된 검체를 환자의 의무기록 및 생산 로트 기록과 신속하게 연계·검색할 수 있는 효율적인 체계를 갖추어 보관하여야 한다. 생체외 형질도입 세포를 제품 출하 시 RCR에 대하여 시험하는 경우에는 보관을 권고하지 않는다.

If the cumulative information sufficiently supports discontinuation of RCR testing as part of your ex vivo retroviral transduced cell product release testing, we recommend archiving a sample for at least 6 months after the product expiration date. We recommend that you retain a sufficient amount (section III.B.2 and Appendix of this document) of the cell product to perform RCR testing in the future if necessary (section IV of this document). Samples should be archived with appropriate safeguards to ensure long-term storage (e.g., a monitored freezer alarm storage system) and an efficient system for the prompt linkage and retrieval of the stored samples with the medical records of the patient and the production lot records. We do not recommend archiving if the ex vivo transduced cells are tested for RCR at product release.

모든 경우에 전체 상층액의 5% 이상을 감염 허용 세포주에서 증폭하여 시험할 것을 권고한다. 종래에는 6리터를 초과하는 벡터 로트에 대하여 300 mL라는 대체 시험 용량을 권고하여 왔다. 이 용량은 당시 감마레트로바이러스 벡터 생산 로트 규모, 참조물질 및 환자 투여량에 관한 경험에 근거하여 설정된 것이다. 그러나 이 권고사항은 현재의 모든 임상 제조 관행에 적용되지 않을 수 있다. 현재의 제조 경험은 임상용 레트로바이러스 벡터 제제에서 투여용량 당량당 RCR 1개 미만이 달성 가능한 수준임을 보여 준다. 따라서 이제는 RCR이 투여용량 당량당 1개의 농도로 존재할 경우 95%의 검출 확률을 보증할 수 있도록 충분한 상층액을 시험할 것을 권고한다.

In all cases, we recommend testing at least 5% of the total supernatant by amplification on a permissive cell line. Historically, we have recommended an alternative testing volume of 300 mL for vector lots over 6 liters. This volume was set based on our experience at the time with gammaretrovirus vector production lot size, reference material, and patient dosing. However, this recommendation may not be applicable to all current clinical manufacturing practices. Current manufacturing experience indicates that <1 RCR/dose equivalent is an achievable level for retroviral vector preparations intended for clinical use. Therefore, we now recommend that sufficient supernatant be tested to ensure a 95% probability of detection of RCR if present at a concentration of 1 RCR/dose equivalent.

이러한 시험 신뢰수준을 달성하기 위한 근거와 적용 수식에 대한 보다 자세한 설명은 이 문서의 부록 1-1의 예에 있다. IND에 포함되는 RCR 시험 절차에 대한 기술에서 시험할 양을 상세히 밝히고 제안한 시험 용량에 대한 정당성을 제시하여야 한다(eCTD의 분석절차 3.2.P.5.2항).

A more detailed explanation of the rationale and the mathematical formulas applied to achieve this level of testing confidence is found in the example in Appendix 1-1 of this document. You should detail the amount to be tested, and provide a justification for the proposed testing volume, in the description of RCR testing procedures included in your IND (in the eCTD section: Analytical Procedures 3.2.P.5.2).

단일 레트로바이러스가 검출된다는 기본 가정을 뒷받침하기 위하여, 개별 RCR 분석법으로 단일 RCR을 검출할 수 있는 용량을 결정하여야 한다. 이 용량의 결정에 근거하여, 전체 시험 용량을 단일 RCR을 검출하는 것으로 입증된 용량을 각각 담은 반복 검체로 나누어야 한다. 대용량 또는 고역가 레트로바이러스 벡터 제제를 사용하는 경우 RCR 검출에서 간섭이 발생할 수 있다. 의뢰자는 대체 접근 방법을 사용하기 위하여 고역가 레트로바이러스 벡터 제제의 간섭 효과를 극복하는 보다 민감한 검출 방법을 개발할 것을 권장한다.

To support the underlying assumption that a single retrovirus will be detected, one should determine a volume in which a single RCR can be detected by an individual RCR assay. Based on the determination of this volume, the total test volume should then be divided into replicate samples, each containing the volume demonstrated to detect a single RCR. When large volumes or high titer retroviral vector preparations are used, interference in RCR detection may occur. Sponsors are encouraged to develop more sensitive detection methods that overcome the interference effect of high titer retroviral vector preparations in order to use the alternative approach.

풀링한 벡터 생산 세포 또는 생체외 형질도입 세포의 1% 또는 10⁸개 중 적은 쪽을 감염 허용 세포주와 공동배양하여 시험할 것을 권고한다. 이 권고사항은 종전 권고사항과 변경되지 않았으며, 1996년 및 1997년 FDA/NIH 유전자치료 학술회의에서 표명된 공개 합의와 일치한다.

We recommend that you test 1% or 10⁸ (whichever is less) pooled vector-producing cells or ex vivo transduced cells by co-culture with a permissive cell line. This recommendation is unchanged from previous recommendations and is consistent with public consensus expressed at the 1996 and 1997 FDA/NIH Gene Therapy Conferences.

벡터 상층액 분석법에는 존재할 수 있는 RCR을 증폭시키기 위하여 감염 허용 세포주에서 상층액을 배양하는 과정이 포함되어야 한다. 마찬가지로 세포 시험은 존재할 수 있는 RCR을 증폭시키기 위하여 감염 허용 세포주와의 공동배양으로 수행하여야 한다. 통상 RCR 배양 분석법에는 최소 5회의 계대가 포함되어 왔다. 분석법 최적화를 통하여 유사한 분석 감도를 달성함이 입증되는 경우에는 더 적은 계대수가 허용될 수 있다.

Vector supernatant assays should include culture of supernatant on a permissive cell line in order to amplify any potential RCR present. Similarly, cell testing should be accomplished by co-culture with a permissive cell line in order to amplify any potential RCR present. Typically, RCR culture assays have included a minimum of five passages. Assay optimization may allow for fewer passages if demonstrated to achieve similar assay sensitivity.

의뢰자는 벡터 설계에 특이적인 바이러스 유입, 증폭 및 입자 생산을 뒷받침하는 RCR 분석법을 개발할 것을 권장하며(예: 생태형 MLV에는 Mus dunni(Ref. 17), VSV-G로 위형화한 HIV-1에는 C8166 세포(Ref. 18), E1001 외피를 가진 HIV-1에는 293F-DCSIGN 세포(Ref. 19)), 특정 생산 시스템은 하나를 초과하는 증폭 세포주를 필요로 할 수 있음에 유의한다. 증폭된 물질은 이후 적절한 지시세포 분석법으로 검출할 수 있다(예: PG-4 S+L-(Ref. 20), XC(Ref. 21), 또는 PERT(Ref. 22), 또는 psi-gag 또는 VSV-G 중합효소 연쇄반응(PCR)(Ref. 23), 또는 상업적으로 입수 가능한 p24 ELISA).

Sponsors are encouraged to develop RCR assays that support virus entry, amplification, and particle production specific to vector design (e.g., Mus dunni for ecotropic MLV (Ref. 17), C8166 cells for VSV-G pseudotyped HIV-1 (Ref. 18), or 293F-DCSIGN cells for E1001 enveloped HIV-1 (Ref. 19), noting that certain production systems may require more than one amplification cell line. The amplified material may then be detected in an appropriate indicator cell assay (e.g., PG-4 S+L- (Ref. 20), XC (Ref. 21), or by PERT (Ref. 22), or by psi-gag or VSV-G polymerase chain reaction (PCR) (Ref. 23), or by a commercially available p24 ELISA.

모든 분석법에는 사용한 검출 방법의 특이성, 감도 및 재현성을 평가하기 위한 적절한 양성 대조와 음성 대조가 포함되어야 한다. 레트로바이러스 벡터 상층액의 각 로트는 벡터 상층액에 첨가한 양성 대조 검체를 사용하여 RCR 검출에 대한 억제 효과를 시험하여야 한다.

All assays should include relevant positive and negative controls to assess specificity, sensitivity, and reproducibility of the detection method employed. Each lot of retroviral vector supernatant should be tested for inhibitory effects on detection of RCR by using positive control samples that are added to vector supernatant.

특히 시간 제약이 있는 경우에는 PCR 같은 대체 방법이 배양 기반 방법을 대신하여 생체외 형질도입 세포의 로트 출하 시험에 적절할 수 있다.

Alternative methods, such as PCR, may be appropriate for lot release testing of ex vivo transduced cells in lieu of culture based methods; particularly, when time constraints are present.

어떠한 대체 방법이든 CBER과 협의하여 개발하여야 한다. 대체 방법의 사용을 뒷받침하기 위하여 감도, 특이성 및 재현성에 관한 자료를 제출하여야 한다.

Any alternative methods should be developed in consultation with CBER. Data on sensitivity, specificity and reproducibility should be provided to support the use of alternative methods.

분석법 개발을 위하여 양성 대조 및 방법 밸리데이션에 사용할 표준 바이러스 스톡을 개발하여야 한다. 표준 바이러스 스톡은 단일 RCR을 측정할 수 있는 용량을 결정하는 데 사용할 수 있다. 감마레트로바이러스 RCR 표준 바이러스 스톡이 개발되어 그 감염성 역가(TCID50)가 결정되었으며, 미국 표준균주 은행(ATCC)(4070A 바이러스) 또는 국립 유전자벡터 보관소(NGVB)(GALV SEATO 바이러스)를 통하여 입수할 수 있다. 감마레트로바이러스 RCR 표준품과 이를 사용하여 RCR 검출을 위한 반복 검체의 크기와 수를 결정하는 방법에 관한 자세한 정보는 이 문서의 부록 1-2 및 1-3을 참조한다. 다른 레트로바이러스 벡터에 대해서는 아직 표준 바이러스 스톡이 개발되지 않았다.

For assay development, you should develop a standard virus stock for use as a positive control and for method validation. The standard virus stock can be used for determination of the volume in which a single RCR can be determined. Gammaretrovirus RCR standard virus stocks have been developed, their infectious titers (TCID50) have been determined, and are available through the American Type Culture Collection (ATCC) (4070A virus) or from the National Gene Vector Biorepository (NGVB) (GALV SEATO virus). Refer to Appendices 1-2 and 1-3 of this document for detailed information about the gammaretrovirus RCR standard and how it can be used to determine the replicate size and number for RCR detection. Standard virus stocks have not yet been developed for other retrovirus vectors.

유전적 배경, 외피 단백질 및 보조 단백질의 결실을 포함하여 임상용 벡터의 특성을 대표하는 자체 표준 바이러스 스톡을 개발할 것을 권고한다. 표준 바이러스 스톡은 RCR 분석법에 사용하는 세포에서의 성장 동태에 대하여 특성분석을 하고 안정성을 시험하여야 한다. 표준 바이러스 스톡은 허가 전에 RCR 분석법을 밸리데이션하는 데 사용하여야 한다. 분석법 밸리데이션에 관한 자세한 정보는 2015년 7월자 FDA의 “Analytical Procedures and Methods Validation for Drugs and Biologics; Guidance for Industry”를 참조한다.⁶

We recommend that you develop an in-house standard virus stock that represents your clinical vector attributes, including, the genetic background, envelope protein, and deletion of accessory proteins. The standard virus stock should be characterized for growth kinetics in the cells used for the RCR assay and tested for stability. The standard virus stock should be used to validate the RCR assay prior to licensure. For more information on assay validation, please refer to FDA’s “Analytical Procedures and Methods Validation for Drugs and Biologics; Guidance for Industry,” dated July 2015.⁶

환자의 능동적 관찰에 관한 종전 FDA 가이던스는 15년 동안 정기적인 간격으로 RCR 시험 및/또는 환자 검체의 보관을 권고하였다(Refs. 4, 24). 현재까지 레트로바이러스 기반 유전자치료를 받은 환자에서 RCR 또는 RCR과 관련된 지연 이상사례는 보고되지 않았다(Refs. 5, 25, 26, 27, 28).

Previous FDA guidance for active patient monitoring recommended RCR testing and/or archiving of patient samples at regular intervals for fifteen (15) years (Refs. 4, 24). To date, RCR or delayed adverse events related to RCR have not been reported in patients who have received retrovirus-based gene therapies (Refs. 5, 25, 26, 27, 28).

관찰 일정에는 다음 시점의 환자 검체 분석을 포함할 것을 권고한다. 즉 치료 전, 이후 치료 후 3개월, 6개월, 12개월 시점의 시험, 그리고 최대 15년까지 매년 시험이다. 치료 후 검체 중 어느 하나라도 양성인 경우에는 CBER과 협의하여 RCR에 대한 추가 분석과 보다 광범위한 환자 추적조사를 실시하여야 한다. 다만 개별 환자의 치료 후 분석 결과가 첫 1년 동안 모두 음성인 경우에는 그 환자에 대하여 매년 추적조사 검체 채취를 중단할 수 있으며, 일반적으로 매년 병력 검토가 그 환자에게 충분할 것이다.

We recommend the monitoring schedule to include analysis of patient samples at the following time points: pre-treatment, followed by testing at three, six, and twelve months after treatment, and yearly for up to fifteen (15) years. If any post-treatment samples are positive, further analysis of the RCR, and more extensive patient follow-up should be undertaken, in consultation with CBER. However, if all post-treatment assays for an individual patient are negative during the first year, collection of the yearly follow-up samples may be discontinued for that individual, and yearly review of medical history will generally be sufficient for the patient.

해당 제품에 대한 환자 관찰 자료가 축적된 후에는 임상시험계획서의 안전성 관찰 부분에서 RCR에 대한 환자 검체의 모든 능동적 시험을 중단하는 근거를 제시할 수 있다. 그 근거에는 RCR 생성 가능성을 낮추는 벡터 설계상의 안전성 요소에 대한 논의는 물론 종전 임상시험 경험의 결과도 포함될 수 있다.

After you have accumulated patient monitoring data with your product, you may provide a rationale to discontinue all active testing of patient samples for RCR in the safety monitoring section of your clinical protocol. The rationale may include a discussion of safety features in the vector design that reduce the likelihood of generating RCR, as well as results of your previous clinical testing experience.

자료가 환자 검체의 능동적 시험 중단을 충분히 뒷받침하는 경우에는, 장기 추적조사의 일부로서 환자 검체를 대신하여 매년 병력 검토를 수집할 것을 권고한다. 이 병력은 암, 신경계 질환 또는 혈액학적 질환과 같이 레트로바이러스 질환을 시사하는 임상 결과의 확인에 초점을 두어야 한다. 장기 추적조사 계획서의 일부로서 매년 장기 추적조사 임상 보고서⁷를 IND에 제출하여야 한다.

If the data sufficiently support discontinuation of active testing of patient samples, we recommend a yearly review of medical history be collected in lieu of patient samples, as a part of long-term follow-up. This history should be targeted towards determination of clinical outcomes suggestive of retroviral disease, such as cancer, neurologic disorders, or hematologic disorders. As part of the long-term follow-up protocol, a yearly long-term follow-up clinical report⁷ should be submitted to the IND.

레트로바이러스 관련 질환을 시사하는 이상사례가 발생하면 관련 임상 검체를 채취하여 RCR에 대하여 시험하여야 한다. 유전자치료 임상시험 중 15년 내에 환자가 레트로바이러스 관련 질환 의심으로 사망하거나 신생물이 발생한 경우에는 신생물 조직의 생검 검체 또는 해당 부검 조직에서 RCR을 분석하여야 한다. 검체 채취 및 보관은 예상되는 시험 전략과 양립하여야 한다. 레트로바이러스 벡터를 사용하는 임상시험에서 환자의 장기 추적조사에 관한 추가 권고사항은 장기 추적조사 가이던스에서 논의한다.

Relevant clinical samples should be collected and tested for RCR upon development of an adverse event suggestive of a retrovirus-associated disease. If patients die of a suspected retrovirus-associated disease or develop neoplasms within 15 years during a gene therapy trial, you should assay for RCR in a biopsy sample of the neoplastic tissue or the pertinent autopsy tissue. Sample collection and storage should be compatible with the expected testing strategy. Additional recommendations for long-term follow-up of patients in clinical trials using retroviral vectors are discussed in the Long Term Follow-up Guidance.

환자에서 RCR 감염의 증거를 검출하기 위하여 현재 사용되는 두 가지 방법을 권고한다. 즉 1) RCR 특이 항체의 혈청학적 검출, 2) RCR 특이 DNA 염기서열에 대한 PCR을 이용한 환자 말초혈액 단핵세포의 분석이다. 분석법의 선택은 벡터, 벡터 투여 방식 및 임상 적응증에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어 VPC의 직접 투여 또는 벡터의 반복 직접 주입은 RCR의 존재와 상관관계가 없는 벡터 특이 항체를 유발할 수 있음이 밝혀졌다(Refs. 29, 30).

We recommend two methods that are currently in use for detecting evidence of RCR infection in patients: 1) serologic detection of RCR-specific antibodies; and 2) analysis of patient peripheral blood mononuclear cells by PCR for RCR-specific DNA sequences. The choice of assay may depend on the vector, mode of vector administration, and the clinical indication. For example, it has been shown that direct administration of VPC or repeat direct injection of a vector can result in vector-specific antibodies that do not correlate with the presence of RCR (Refs. 29, 30).

따라서 벡터 또는 VPC를 직접 투여하는 경우에는 혈청학적 관찰보다 PCR 분석법이 더 바람직할 수 있다. 또한 환자가 항체 생성이 미미하거나 전혀 이루어지지 않을 정도로 면역저하 상태인 경우에도 혈청학적 관찰보다 PCR에 의한 환자 검체 관찰이 더 바람직할 수 있다. 어느 경우든 확인된 모든 양성 결과는 감염성 바이러스 분리체를 확보하고 특성분석하기 위하여 직접 배양 분석법으로 추적하여야 한다.

Therefore, in cases where vector or VPCs are directly administered, a PCR assay may be preferable over serologic monitoring. Additionally, monitoring of patient samples by PCR may be preferable over serologic monitoring if the patients are immunocompromised to an extent that antibody production may be minimal or not at all. In either situation, all confirmed positive results should be pursued by direct culture assay to obtain and characterize the infectious viral isolate.

생산 로트 및 환자 관찰에서 나온 RCR 시험 결과는 IND 파일의 보완자료에 문서화하여야 한다. 환자 관찰에서 나온 양성 결과는 IND 안전성 보고의 형태로 이상경험으로서 즉시 보고하여야 한다(21 CFR 312.32). 음성 결과는 IND 연차 보고(21 CFR 312.33)로 보고하거나, 연차 보고를 대신하여 사용하는 경우 개발 중 안전성 갱신 보고서(DSUR)로 보고하여야 한다. 또한 RCR 시험 분석법에 관한 자료의 축적을 촉진하기 위하여, CBER은 유전자치료 분야의 구성원들이 서로 다른 벡터 생산 세포주, 환자 관찰 및 안전성에 관한 경험 자료를 발표하거나 공개적으로 논의할 것을 권장한다.

RCR testing results from production lots and patient monitoring should be documented in amendments to the IND file. Positive results from patient monitoring should be reported immediately as an adverse experience in the form of an IND safety report (21 CFR 312.32). Negative results should be reported by way of the IND annual report (21 CFR 312.33) or Development Safety Update Report (DSUR), if used in lieu of reporting in annual reports. In addition, to enhance the accumulation of data on RCR testing assays, CBER encourages members of the gene therapy community to publish data and/or discuss data publicly regarding their experience with different vector producer cell lines, patient monitoring, and safety.

레트로바이러스 벡터 기반 유전자치료제의 표시기재(labeling)에 RCR과 관련된 즉각적 위험 및 장기적 위험을 명확히 제시하는 관련 자료와 정보를 포함할 것을 권고한다. RCR 시험은 레트로바이러스 벡터의 중요한 안전성 시험이므로, 벡터 제조 및 출하 중 RCR 시험은 허가 후에도 계속하여야 한다.

We recommend that labeling for retroviral vector-based gene therapy products incorporate relevant data and information to clearly present the immediate and long-term risks associated with RCR. As a critical safety test for retroviral vectors, testing for RCR during vector manufacture and release should continue after licensure.

생물의약품 허가신청(BLA)⁸을 제출하는 시점에는 해당 제품에서 RCR이 발생할 유의한 위험이 있는지를 판단할 수 있을 만큼 충분한 제조 및 임상 안전성 자료를 축적하였어야 한다. 이 위해성 평가는 해당 제품에 대하여 허가 후 주기적인 환자 RCR 관찰이 필요하지 않다고 제안하는 데 사용할 수 있다. 그러나 레트로바이러스 관련 질환을 시사하는 이상사례가 발생하면 RCR 시험을 위하여 환자로부터 관련 임상 검체를 채취한다는 조항을 BLA에 포함하여야 한다. 제품 투여 후 15년 이내에 환자가 레트로바이러스와 관련되었을 가능성이 있는 질환으로 사망하거나 신생물이 발생한 경우에는, 신생물 조직의 생검 검체 또는 해당 부검 조직에서 RCR을 분석하기 위하여 모든 노력을 기울여야 한다.

At the time of submission of your Biologics License Application (BLA),⁸ you should have accumulated sufficient manufacturing and clinical safety data to determine whether there is a significant risk of RCR developing with your product. This risk assessment may be used to propose that periodic patient monitoring for RCR would not be warranted for your product post-licensure. However, you should include a provision in the BLA to collect relevant clinical samples from patients for RCR testing upon development of an adverse event suggestive of a retrovirus-associated disease. In the event patients die from a disease potentially associated with a retrovirus or develop neoplasms within 15 years following product administration, every effort should be made to assay for RCR in a biopsy sample of the neoplastic tissue or the pertinent autopsy tissue.

이러한 허가 후 고려사항에는 장기 추적조사 가이던스에 따라 투여 후 최대 15년까지 계속되는 환자 장기 추적조사도 포함하여야 한다. 자세한 정보는 장기 추적조사 가이던스의 VI항(“General Considerations for Post-Marketing Monitoring Plans for Gene Therapy Products”)을 참조한다.

These post-licensure considerations should also include continued long-term patient follow-up, up to fifteen (15) years after dosing, in accordance with the Long Term Follow-up Guidance. For more information, refer to section VI of the Long Term Follow-up Guidance (“General Considerations for Post-Marketing Monitoring Plans for Gene Therapy Products”).

RCR이 생산 로트에 농도(c)로 존재하고 분석법이 검체 중 단 하나의 레트로바이러스도 검출한다고 가정하면, 부피(V_t) 중 RCR의 수는 모수가 cV_t인 포아송 분포를 따르므로 부피(V_t)에서 레트로바이러스를 검출할 확률(p)은 다음 수식으로 주어진다. p = 1-exp(-cV_t) V_t에 대하여 풀면 다음 식을 얻는다.

Assuming the RCR are present in the production lot at a concentration (c) and that an assay will detect a single retrovirus in the sample, the probability (p) of detecting retrovirus in a volume (V_t) is given by the formula: p = 1-exp(-cV_t), because the number of RCR in V_t follows a Poisson distribution with a parameter cV_t. Solving for V_t, one gets the following equation:

여기서 ln은 자연로그를 뜻한다.

where ln denotes the natural logarithm.

이 수식을 사용할 때에는 p 값을 0.95로 설정하는 것이 권장된다. 이 문서의 부록 1-3에서 정한 권고 반복 검체 크기와 수를 적용하면, p는 생산 로트에서 RCR을 검출할 확률이 된다.

For the use of this formula, it is recommended that the value for p be set at 0.95. With the recommended replicate size and number defined in Appendix 1-3 of this document, p becomes the probability of detecting an RCR in the production lot.

c 값은 투여용량 당량당 RCR 1개 이하로 설정할 것을 권고한다. 생산 로트 중 RCR 농도가 투여용량 당량당 1개 이상이면 검출 확률은 0.95 이상이다. 생산 로트에 RCR이 투여용량 당량당 1개 미만의 농도로 들어 있으면 RCR이 검출되지 않아 환자에게 투여될 수 있다. 또한 투여용량 당량은 한 번에 투여할 것으로 예상되는 벡터의 최대량으로 정의할 것을 권고한다. 생체외에서 유전적으로 변형된 세포의 경우, 투여용량 당량은 각 생산 로트에서 최대 수의 표적 세포를 형질도입하는 데 사용하는 벡터의 양이다.

We recommend that the value for c be set no higher than 1 RCR/dose equivalent. If the concentration of RCR in the production lot is 1 RCR/dose equivalent or greater, then the probability of detection is at least 0.95. If the production lot contains RCR at a concentration of <1 RCR/dose equivalent, the RCR may not be detected and would be administered to the patient. We also recommend that a dose equivalent be defined as the maximum amount of vector expected to be administered at one time. For ex vivo genetically modified cells, a dose equivalent is the amount of vector used to transduce the maximum number of target cells for each production lot.

권고된 p 값과 c 값을 적용하면, 시험할 레트로바이러스 상층액의 총 부피는 로트 크기와 관계없이 다음과 같이 계산한다.

With the recommended value for p and c, the total volume of retroviral supernatant to be tested, independent of lot size, is calculated as follows:

직접 투여 예: 제품을 1x10¹⁰ TU(형질도입 단위)로 투여하는 경우

Direct administration example: If your product is administered at 1x10¹⁰ TU (transducing unit)

생체외 유전자 변형 예: 역가 1x10⁷ TU/mL의 벡터로 감염다중도(MOI) 0.5에서 최대 1x10⁸개의 세포를 형질도입하려는 경우:

Ex vivo genetic modification example: If you aim to transduce up to 1x10⁸ cells at an MOI (multiplicity of infection) of 0.5 with a titer of 1x10⁷ TU/mL:

더 적은 부피를 사용하려는 제안은 CBER과 협의하여 마련하고 검토하여야 한다.

Proposals to use smaller volumes should be developed and reviewed in consultation with CBER.

ATCC와 협력하여, 양쪽성 외피를 지닌 VPC에서 생성될 수 있는 RCR의 존재를 검출하는 데 사용하는 분석법의 감도 결정 및 밸리데이션에 사용할 표준 감마레트로바이러스 스톡(ATCC # VR-1450)이 확립되었다. 이 스톡은 RCR 검출에 대한 상대적 분석 감도를 결정하는 데 사용할 수 있다. 이 정보는 이후 단일 레트로바이러스의 검출을 보장하는 시험 대상 레트로바이러스 상층액 반복 검체의 크기를 결정하고, 그에 따라 이 가이던스(이 문서의 부록 1-3)에서 정한 적절한 총 부피 V_t를 보장하는 반복 검체의 수를 결정하는 데 사용할 수 있다. 이 바이러스 스톡은 외피 암호화 영역이 양쪽성 MLV 4070A 균주의 것으로 치환된 MoMLV를 암호화하는 분자 클론으로 형질주입한 세포주에서 유래한다(Ref. 31).

In collaboration with the ATCC, a standard gammaretroviral stock (ATCC # VR-1450) has been established for use in determination of sensitivity and validation of assays used to detect the presence of RCR which would be produced from VPC containing an amphotropic envelope. This stock can be used to determine the relative assay sensitivity for detecting RCR. This information can subsequently be used to determine the size of replicates of retroviral supernatant to be tested that will ensure detection of a single retrovirus and thus, the number of replicates to ensure an adequate total volume, V_t, as specified in this guidance (Appendix 1-3 of this document). The virus stock is derived from a cell line which has been transfected with a molecular clone encoding MoMLV with a substitution of the envelope coding region from the 4070A strain of amphotropic MLV (Ref. 31).

따라서 이 바이러스 스톡은 MLV 외피 암호화 염기서열을 지닌 레트로바이러스 패키징 세포주에서 생성될 수 있는 전형적인 재조합 바이러스를 대표한다.

Therefore, this virus stock represents a typical recombinant virus that could be generated in a retroviral packaging cell line containing coding sequences for a MLV envelope.

표준 바이러스 스톡과 그 감염성 역가는 레트로바이러스 벡터 중 RCR 검출에 사용하는 분석방법의 상대적 감도를 실험적으로 결정하기 위한 양성 대조로 사용할 수 있다. 특히 이 스톡을 사용하면 연구자는 단일 RCR을 검출할 수 있는 최대 시험 부피를 결정할 수 있다. 레트로바이러스 벡터 입자가 RCR 검출에 미치는 저해 효과를 통제하기 위하여, 이 결정은 생산 로트를 대표하는 레트로바이러스 벡터 상층액이 있는 상태에서 수행하여야 한다. 이 표준품을 이용할 수 있으므로 개별 연구자는 자신의 실험실에서 이 방법론을 확립할 수 있을 것이며, RCR 검출을 위한 대체 방법도 탐색할 수 있을 것이다.

The standard virus stock and its infectious titer can be used as a positive control to empirically determine the relative sensitivity of assay methods used for detection of RCR in retroviral vectors. In particular, this stock will allow investigators to determine the largest test volume in which a single RCR can be detected. The determination should be performed in the presence of a retroviral vector supernatant typical of a production lot in order to control for inhibitory effects of the retroviral vector particles on detection of RCR. Availability of this standard should allow individual investigators to establish this methodology in their own laboratories, as well as allow exploration of alternative methods for detection of RCR.

개별 RCR 분석법으로 단일 RCR을 검출할 수 있는 부피(이 문서의 부록 1-2의 RCR 표준품을 사용하여 결정)에 따라, 검체 중 RCR의 검출을 보장하기 위하여 총 시험 부피를 여러 개의 반복 검체로 나누어야 할 수 있다. 반복 검체의 수(r)는 다음 수식으로 결정할 수 있다.

Depending on the volume in which a single RCR can be detected by an individual RCR assay (as determined by use of the RCR standard, Appendix 1-2 of this document), it may be necessary to divide the total test volume into several replicate samples to ensure the detection of RCR in the sample. The number of replicates (r), can be determined using the formula,

여기서 V_s는 RCR 1개를 일관되게 검출할 수 있는 부피이다(V_t의 결정은 이 문서의 부록 1-1 참조).

where V_s is the volume in which one RCR can be consistently detected (Appendix 1-1 of this document for determination of V_t).